辣椒EST-SSR分布特征及其相關(guān)應(yīng)用研究.pdf

1、辣椒(Capsicum spp.L，2n=24)屬茄科，辣椒屬，是世界性的蔬菜和加工調(diào)味品，現(xiàn)已為我國第二大蔬菜作物。來源于DNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域的EST(Expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)可直接反映群體中相關(guān)基因的多樣性。蔬菜作物尤其是辣椒在EST數(shù)據(jù)庫應(yīng)用上相對(duì)薄弱，而隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，利用生物信息學(xué)手段對(duì)辣椒ESTs進(jìn)行大規(guī)模分析顯得日益重要。本文對(duì)116，952條辣椒EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分

2、析，開發(fā)新標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋，在此基礎(chǔ)上對(duì)辣椒種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行了分析，以及對(duì)辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選，以期為加密辣椒遺傳圖譜、分子進(jìn)化、發(fā)掘新基因以及基因定位奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　 ⑴辣椒EST-SSR標(biāo)記開發(fā)和功能注釋。為了在辣椒開發(fā)EST-SSR功能性標(biāo)記，利用生物信息學(xué)方法對(duì)從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的116，952條辣椒EST序列進(jìn)行EST-SSR特征分析。通過軟件除去冗余序列后得到

3、86，496條非冗余序列，利用SSRLoctor軟件對(duì)其進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)1，736個(gè)微衛(wèi)星分布于1，658條EST序列中，EST-SSR序列出現(xiàn)頻率為1.92％，其中64條EST序列含有多個(gè)SSR位點(diǎn)。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的56.4％，其次是三核苷酸重復(fù)類型，占23.3％。共檢測(cè)到149種基序重復(fù)類型，重復(fù)基序出現(xiàn)頻率最高的為GA/TC，占23.3％，AG/CT其次，占17.O％.1658條

4、EST序列中有810條可用于引物設(shè)計(jì)，功能注釋分析后發(fā)現(xiàn)其中的426條可以被劃分為三大功能類，結(jié)果表明具有生物進(jìn)程、細(xì)胞組成和分子功能的EST序列分別為297、271和316條，在Level2上，功能注釋結(jié)果可分成30個(gè)亞類。這426條序列功能注釋時(shí)，單條EST序列可能同時(shí)被注釋有多種功能。
　　 ⑵EST-SSR的辣椒遺傳多樣性分析。從設(shè)計(jì)的810對(duì)EST-SSR引物中隨機(jī)選擇100對(duì)引物對(duì)17份辣椒材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)

5、果表明：80對(duì)EST-SSR引物能夠得到有效擴(kuò)增，其中46對(duì)引物表現(xiàn)多態(tài)性擴(kuò)增，多態(tài)性頻率達(dá)57.5％。每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因數(shù)1～3個(gè)，平均1.9個(gè)。經(jīng)由NTSYS2.10軟件根據(jù)材料間的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為0.718時(shí)，將供試的17份辣椒材料分為6個(gè)亞類，產(chǎn)地來源相同的辣椒材料基本聚集在一起，從而表明開發(fā)的EST-SSR進(jìn)行辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析是可行的，并將這些材料進(jìn)一步分類、保存和利用提供了理

6、論依據(jù)。
　　 ⑶辣椒抗黃瓜花葉病毒(CMV)EST-SSR分子標(biāo)記篩選。以抗、感CMV材料VC16a和SS69及其F2抗、感基因池為材料，利用80對(duì)辣椒EST-SSR引物對(duì)其進(jìn)行抗CMV基因的分子標(biāo)記篩選，其中52對(duì)引物能夠產(chǎn)生預(yù)期片段，有效擴(kuò)增率達(dá)65.0％，擴(kuò)增的主條帶數(shù)為1～5條，引物Y6在抗、感基因池中擴(kuò)增出158bp的多態(tài)性片段，命名為Y6158，經(jīng)F2單株驗(yàn)證、分析后表明Y6158與辣椒抗黃瓜花葉病毒病基因連鎖，其