全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南

1、全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南要點(diǎn)解析,山東省疾病預(yù)防控制中心病毒病所電話：0531-82679686/82679461E-mail:crbfzs@vip.163.com,,所有講課PPT都將放在我們公共郵箱里： 郵箱名：crbfzs@163.com 密碼：crbfzs,內(nèi)容,監(jiān)測(cè)目的流感樣病例監(jiān)測(cè)流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè),一、監(jiān)測(cè)目的,監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)水平和流行動(dòng)態(tài)；及時(shí)發(fā)現(xiàn)流感病毒變異并做出預(yù)警

2、；為全球及我國(guó)流感疫苗毒株的預(yù)測(cè)和推薦提供依據(jù)。,二、流感樣病例監(jiān)測(cè),監(jiān)測(cè)對(duì)象和時(shí)間,監(jiān)測(cè)對(duì)象：流感樣病例，即發(fā)熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。監(jiān)測(cè)時(shí)間 ：所有國(guó)家級(jí)流感樣病例監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院和流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室均全年開展流感樣病例監(jiān)測(cè)。,監(jiān)測(cè)診室的設(shè)置,城市綜合醫(yī)院在內(nèi)科門診、內(nèi)科急診、發(fā)熱門診和（或）兒內(nèi)科門診、兒內(nèi)科急診開展流感樣病例的監(jiān)測(cè)；內(nèi)科門診開展流感樣病例監(jiān)測(cè)的診室應(yīng)包括所有內(nèi)科診室和感染性疾病科。注：包括監(jiān)測(cè)

3、哨點(diǎn)醫(yī)院設(shè)置的發(fā)熱門診和感染性疾病科。城市兒童醫(yī)院在兒內(nèi)科門診、兒內(nèi)科急診和（或）發(fā)熱門診開展流感樣病例的監(jiān)測(cè)。不能僅將發(fā)熱門診設(shè)為監(jiān)測(cè)診室,哨點(diǎn)醫(yī)院監(jiān)測(cè)診室的醫(yī)務(wù)人員，按照流感樣病例的定義，每天按科室登記各年齡組的流感樣病例數(shù)和門急診病例就診總數(shù)，由哨點(diǎn)醫(yī)院主管科室每日收集、匯總后，于每周一將本院各監(jiān)測(cè)診室上周數(shù)據(jù)錄入到“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”。各市疾控中心每周一15時(shí)之前對(duì)本轄區(qū)監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院報(bào)告的數(shù)據(jù)進(jìn)行審核，并將數(shù)據(jù)匯總

4、后傳真至省疾控中心。流感樣病例數(shù)和門急診病例就診總數(shù)在每個(gè)監(jiān)測(cè)診室的產(chǎn)生來源必須一致。,流感樣病例的報(bào)告,,北方省份每家哨點(diǎn)醫(yī)院在4-9月份每月采集5-15份流感樣病例標(biāo)本，10月-次年3月每周采集10-15份流感樣病例標(biāo)本。應(yīng)避免集中、突擊采樣。采樣對(duì)象：發(fā)病3天內(nèi)的流感樣病例。標(biāo)本采集種類包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子。標(biāo)本采集后放入含3-4ml采樣液的采樣管中。,流感樣病例標(biāo)本的采集,標(biāo)本采集后在保證生物安全條件下在48h

5、內(nèi)運(yùn)送至相應(yīng)的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，保存溫度為4℃以下；如未能48h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)置-70℃或以下保存，并應(yīng)保證采集的標(biāo)本1周內(nèi)送到對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。全國(guó)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的工作人員接到標(biāo)本后，48h內(nèi)將“流感樣病例標(biāo)本原始登記送檢表”錄入到“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”中。,流感樣病例標(biāo)本運(yùn)送,,,生物安全：BSL-2級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室具備病毒分離能力的實(shí)驗(yàn)室：利用狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。MDCK細(xì)胞病

6、毒分離陽(yáng)性再用雞胚進(jìn)行病毒分離。 不具備病毒分離能力的實(shí)驗(yàn)室：收到標(biāo)本后1周內(nèi)利用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行流感病毒亞型鑒定。檢測(cè)結(jié)果在檢測(cè)完成后48h內(nèi)錄入“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”。,流感樣病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),核酸檢測(cè)的及時(shí)性,,目前多采用雞胚和MDCK細(xì)胞進(jìn)行流感病毒分離。通過雞胚分離的流感毒株與原始標(biāo)本的抗原性和基因特性可能會(huì)有所不同，而通過MDCK細(xì)胞所分離的流感病毒與原始標(biāo)本相似。且MDCK細(xì)胞對(duì)“O”相毒株的敏感性遠(yuǎn)高于

7、雞胚，故MDCK細(xì)胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。但目前全球主要使用雞胚進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)，MDCK細(xì)胞分離的病毒在很多國(guó)家尚未批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)，因此雞胚分離仍然發(fā)揮著舉足輕重的作用。,,,,,流感樣病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),標(biāo)本處理：收到標(biāo)本后，24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本處理和病毒分離，將原始標(biāo)本分為三份，一份接種MDCK細(xì)胞接種，一份雞胚接種，一份-70℃或以下溫度保存待復(fù)核；標(biāo)本集中、收獲和鑒定：培養(yǎng)1次的陰性標(biāo)本可不再進(jìn)行盲傳，對(duì)血凝

8、滴度小于1:16的毒株，稀釋后進(jìn)行傳代。,流感樣病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室將分離到的所有符合上送標(biāo)準(zhǔn)的流感毒株，同時(shí)上送國(guó)家流感中心和省級(jí)疾病預(yù)防控制中心 。標(biāo)本采集到送至國(guó)家流感中心的時(shí)間不超過1個(gè)月。 注：上送標(biāo)準(zhǔn)：HA≥1:16,血凝抑制試驗(yàn)分型，量不低于5.5毫升（國(guó)家3毫升，省疾控中心2.5毫升）每個(gè)開展病毒分離的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室向國(guó)家流感中心上送流感毒株數(shù)量每年不低于30株，流行季節(jié)每月不少于5株。,,,,

9、,省級(jí)參比中心評(píng)估方案要求,?。▍^(qū)、市）內(nèi)2/3的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室開展流感病毒分離工作；全?。▍^(qū)、市）連續(xù)2年每家開展流感病毒分離的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室每年送國(guó)家流感中心的毒株不少于30株；全省（區(qū)、市）連續(xù)2年送國(guó)家流感中心的毒株復(fù)核一致率在90%以上。,流感樣病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),毒株保存：液體毒株可在-70℃或以下溫度保存3年，凍干保存毒株可在4 ℃及以下溫度條件長(zhǎng)期保存，各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)分離出病毒株的原始標(biāo)本應(yīng)在-70℃及以下溫度保存至少6個(gè)月。各網(wǎng)

10、絡(luò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)HA陽(yáng)性不能區(qū)分型別或亞型的毒株和陽(yáng)性標(biāo)本務(wù)必在48小時(shí)內(nèi)送至國(guó)家流感中心。,,,三、流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè),暴發(fā)疫情定義,指一個(gè)地區(qū)或單位短時(shí)間出現(xiàn)異常增多的流感樣病例。報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：（1）1周內(nèi)，在同一學(xué)校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；或發(fā)生2例及以上有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的死亡病例。（2）在某一社區(qū)內(nèi)（如同一村莊或街道辦事處）一周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病

11、例異常增多?？筛鶕?jù)本地疫情特點(diǎn)及防控工作需要，制定更為敏感的暴發(fā)疫情報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。,我省流感監(jiān)測(cè)方案（2012版）對(duì)流感樣病例聚集疫情和暴發(fā)疫情報(bào)告要求：,⒈流感樣病例聚集疫情監(jiān)測(cè)⑴學(xué)校、托幼機(jī)構(gòu)在同一班級(jí)或集體單位同一部門一周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例5例以上（含5例），或同一宿舍超過3例以上（含3例），應(yīng)立即報(bào)告屬地縣（市、區(qū)）疾病預(yù)防控制中心報(bào)告?？h（市、區(qū)）疾病預(yù)防控制中心接到報(bào)告后，應(yīng)立即趕赴現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行疫情核實(shí)、開展流行病學(xué)調(diào)查，并采集

12、標(biāo)本。調(diào)查報(bào)告應(yīng)盡快逐級(jí)上報(bào)給省疾病預(yù)防控制中心，采集標(biāo)本應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)送達(dá)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。 ⑵學(xué)校、托幼機(jī)構(gòu)在同一年級(jí)或集體單位一周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例10例以上（含10例）、30例以下（不含30例），應(yīng)立即報(bào)告所在地縣（市、區(qū)）疾病預(yù)防控制中心。縣（市、區(qū)）疾病預(yù)防控制中心接到報(bào)告后立即報(bào)告市級(jí)疾控機(jī)構(gòu)，并及時(shí)趕赴現(xiàn)場(chǎng)開展流行病學(xué)調(diào)查、采集標(biāo)本。核實(shí)疫情后，2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)，調(diào)查報(bào)告及時(shí)逐級(jí)上報(bào)省疾病預(yù)防控制中心，同時(shí)報(bào)告當(dāng)

13、地衛(wèi)生行政部門和通報(bào)教育行政部門。采集標(biāo)本應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)送達(dá)流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。在聚集性疫情調(diào)查處理的過程中，根據(jù)疫情進(jìn)展情況，及時(shí)對(duì)首次報(bào)告、進(jìn)程報(bào)告和結(jié)案報(bào)告進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)。,,⒉流感樣病例暴發(fā)疫情監(jiān)測(cè)⑴流感樣病例暴發(fā)是指一個(gè)地區(qū)或單位短時(shí)間出現(xiàn)異常增多的流感樣病例：1周內(nèi)，在同一學(xué)校、幼兒園或其他集體單位發(fā)生30例及以上流感樣病例；或發(fā)生5例及以上因流感樣癥狀住院病例（不包括門診留觀病例）；在某一社區(qū)內(nèi)（如同一村莊或街道辦事處）一

14、周內(nèi)出現(xiàn)流感樣病例異常增多。,各疫情單位發(fā)現(xiàn)流感樣病例聚集性病例或暴發(fā)疫情后，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)以電話或傳真等方式向?qū)俚乜h級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)（農(nóng)村學(xué)校向當(dāng)?shù)剜l(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院防保組）報(bào)告?？h級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)或鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院防保組及時(shí)核實(shí)疫情，如達(dá)到報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)。,暴發(fā)疫情的發(fā)現(xiàn)與報(bào)告,,（1）首例發(fā)病時(shí)間填寫本次暴發(fā)疫情中第一例流感樣病例的發(fā)病時(shí)間，末例發(fā)病時(shí)間填寫本次暴發(fā)疫情中最后一例流感樣病例的發(fā)病時(shí)間。（2）暴發(fā)疫情事件中

15、的確診病例要與“疾病監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理系統(tǒng)”中的病例個(gè)案進(jìn)行關(guān)聯(lián)，未在“疾病監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理系統(tǒng)”報(bào)告的確診病例要進(jìn)行補(bǔ)報(bào)。（3）承擔(dān)檢測(cè)工作的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，要在“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”中錄入標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。報(bào)告該起疫情的疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)將標(biāo)本信息和“疾病監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理系統(tǒng)”中病例個(gè)案進(jìn)行關(guān)聯(lián)。（4）在暴發(fā)疫情調(diào)查處理的進(jìn)程中，各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要及時(shí)對(duì)《流感樣病例暴發(fā)疫情報(bào)告表》首次報(bào)告并進(jìn)行更新，并做好進(jìn)程報(bào)告和結(jié)案報(bào)

16、告。,,,,采集發(fā)病3天內(nèi)流感樣病例的鼻、咽、咽鼻拭子標(biāo)本，必要時(shí)可采集急性期（發(fā)病7天內(nèi)）和恢復(fù)期（發(fā)病2-4周）雙份血清標(biāo)本。每一起暴發(fā)疫情至少采集10份咽、鼻拭子標(biāo)本（如果現(xiàn)癥病例在10例以下的，應(yīng)全部采樣）。不能明確病原的可增加采樣批次和數(shù)量。標(biāo)本運(yùn)輸：4℃條件下，于24小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室 。,暴發(fā)疫情標(biāo)本采集,所有網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到暴發(fā)疫情標(biāo)本后，24h內(nèi)利用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行流感病毒亞型鑒定，檢測(cè)結(jié)果在檢測(cè)完成后2

17、4h內(nèi)上報(bào)“中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)”。具備流感病毒分離能力的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室：對(duì)核酸檢測(cè)流感病毒陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。每起暴發(fā)疫情至少對(duì)5份核酸檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本開展病毒分離，如采集標(biāo)本數(shù)或核酸檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本數(shù)小于5份，則對(duì)全部標(biāo)本均進(jìn)行病毒分離。,暴發(fā)疫情標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),,2011年4月1日至今，山東省共報(bào)告8起流感樣病例聚集性疫情和暴發(fā)疫情，其中濟(jì)南市報(bào)告2起，濟(jì)寧市報(bào)告6起，共報(bào)告流感樣病例病419例，6起發(fā)生在中小學(xué)，2起發(fā)生

18、在村莊；經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，3起為B型流感，2起為甲型H3N2流感，2起為腺病毒感染，1起未確定性質(zhì)。8起疫情共采集標(biāo)本92份，對(duì)其中11份進(jìn)行了病毒分離，1份H3N2陽(yáng)性，對(duì)73份標(biāo)本進(jìn)行了核酸檢測(cè)，27份B型陽(yáng)性，11份H3N2陽(yáng)性。,,,,,,,,,,,,,,,,,四、流感樣病例標(biāo)本采集,標(biāo)本種類臨床標(biāo)本 鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物等血清標(biāo)本 病人的急性期和恢復(fù)期雙份血清,流感病毒標(biāo)本采集,臨床樣本收集的

19、注意事項(xiàng)要做好自我保護(hù)，操作要細(xì)心，嚴(yán)防標(biāo)本間交叉污染采集禽流感疑似病人的標(biāo)本，最好采集下呼吸道吸取物采集標(biāo)本要有一定力度標(biāo)本采集后應(yīng)迅速至于冰上或者4 ℃以下保存，因?yàn)榱鞲胁《緦?duì)熱很敏感,,臨床標(biāo)本處理,鼻、咽拭子：為帶有聚丙烯纖維的拭子標(biāo)本，應(yīng)先將帶有聚丙烯纖維的拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。鼻咽抽取液：用干凈滅菌的毛細(xì)吸管在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液

20、可直接接種或低溫保存。組織標(biāo)本的處理：取肺組織標(biāo)本放至平皿中，用滅菌生理鹽水清洗肺組織2～3遍，研磨成組織懸液，配置成10％～20％的組織懸液，2000rpm離心10min，加入抗菌素，取上清直接接種。如原始采樣液中未加入抗菌素，應(yīng)在標(biāo)本接種前補(bǔ)加，慶大霉素終濃度為10mg/mL，青/鏈霉素（終濃度:青霉素G 100U/mL,硫酸鏈霉素100μg/mL），混勻后置4℃過夜或作用2h后進(jìn)行接種。,血清學(xué)標(biāo)本注意事項(xiàng)應(yīng)采集急性期

21、和恢復(fù)期的雙份血清采集空腹血,標(biāo)本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈的塑料管里，擰緊；將密閉后的標(biāo)本放入大小適合的塑料袋內(nèi)密封；每袋裝一份標(biāo)本；在采樣管上用油性記號(hào)筆做好標(biāo)記用塑料袋密封。同時(shí)填寫“流感/人禽流感監(jiān)測(cè)病例標(biāo)本原始登記表”，用另一塑料袋密封；將裝標(biāo)本的密封袋放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標(biāo)本，可以放在同一個(gè)塑料袋內(nèi)再次做密封。所有容器必須

22、有生物危險(xiǎn)標(biāo)識(shí)。,臨床標(biāo)本的包裝,,五、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),2024/3/18,55,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,樣本采集,,,鼻咽拭子,,,雙份血清,,,快速診斷,,,血凝抑制試驗(yàn)或中和試驗(yàn),,,,,分型鑒定,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,病毒分離,常采用雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法流感病毒分離：生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室禽流感病毒分離：生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,病毒分離方法,正常細(xì)胞,病變細(xì)胞,病毒分離注意

23、事項(xiàng),細(xì)胞分離流感病毒 選擇敏感MDCK細(xì)胞 細(xì)胞70～90％成片 雞胚分離流感病毒 9日齡SPF雞胚 季節(jié)型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接種分離病毒 人禽流感病毒尿囊腔分離病毒,流感病毒操作要求生物安全規(guī)程禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理接種未知臨床標(biāo)本和已知標(biāo)準(zhǔn)病毒禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理接種采自不同動(dòng)物的標(biāo)本 動(dòng)物標(biāo)本（如豬、

24、禽等）必須與人的標(biāo)本分別保存,流感病毒實(shí)驗(yàn)室交叉污染的避免,鑒定方法血清學(xué)方法紅細(xì)胞凝集及凝集抑制試驗(yàn)其它方法核酸檢測(cè)快速檢測(cè)試劑盒,流感病毒鑒定,使用的試劑可靠無誤紅細(xì)胞懸液濃度是否合適處理后的血清有無殘余非特異性凝集素選用標(biāo)準(zhǔn)抗血清是否準(zhǔn)確讀取HA試驗(yàn)的結(jié)果是否正確4個(gè)血凝單位是否準(zhǔn)確紅細(xì)胞陰性對(duì)照待鑒定病毒確保沒有被細(xì)菌污染稀釋血清、病毒、紅細(xì)胞懸液加入量準(zhǔn)確,紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)注意事項(xiàng),RT-PCR