自身免疫病與自身抗體的檢測(cè)

1、自身免疫病與自身抗體的檢測(cè),與自身免疫性疾病相關(guān)的基本概念,免疫 機(jī)體識(shí)別和排除抗原性異物的功能，也就是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激所產(chǎn)生的以排除抗原為目的的生理過(guò)程。 體液免疫--- 產(chǎn)生抗體細(xì)胞免疫---致敏淋巴細(xì)胞,與自身免疫性疾病相關(guān)的基本概念,隱蔽抗原：機(jī)體有些組織成分由于解剖位置的特殊性，正常情況下終生不與免疫系統(tǒng)接觸，稱為隱蔽抗原。眼晶狀體、葡萄膜---交感性眼炎；精子—男性不育。,與

2、自身免疫性疾病相關(guān)的基本概念,自身免疫：是指機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身抗體和（或）致敏淋巴細(xì)胞的現(xiàn)象。,與自身免疫性疾病相關(guān)的基本概念,自身免疫?。?是指在各種內(nèi)外因素的作用下，自身免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，超過(guò)了生理性自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)度且持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，造成對(duì)正常細(xì)胞、器官的功能與結(jié)構(gòu)的破壞，呈現(xiàn)與此損傷相關(guān)的臨床表現(xiàn)及免疫學(xué)異常。,自身免疫性疾病發(fā)生的原因,機(jī)體抗原特異性淋巴細(xì)胞發(fā)生異常，對(duì)正常組織發(fā)生

3、免疫應(yīng)答狀態(tài)；機(jī)體自身組織成分發(fā)生改變從而引起的免疫應(yīng)答狀態(tài)。,自身免疫病的基本特征,多數(shù)自身免疫病的病因不清，有些自身免疫病的發(fā)生和復(fù)發(fā)似乎與某些外因有關(guān)，但大多數(shù)自身免疫病是“自發(fā)”地發(fā)生的，目前未找到肯定的外因。,自身免疫病的基本特征,血液中可檢出高滴度的自身抗體和（或）與自身組織成分起反應(yīng)的致敏淋巴細(xì)胞。,自身免疫病的基本特征,組織器官損傷和功能障礙的范圍取決于自身抗原分布:器官特異性自身免疫?。簶虮臼霞谞钕傺?，非器官特

4、異性自身免疫?。喝缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）。,自身免疫病的基本特征,自身免疫病的發(fā)生與多因素相關(guān)，包括遺傳因素、性別差異、年齡大小、氣候環(huán)境及地理位置等。,自身免疫病的基本特征,遺傳因素： 強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者90%為HLA--B27陽(yáng)性，然而在HLA--B27陽(yáng)性的人群中發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎的可能僅為2%，而第一級(jí)HLA--B27陽(yáng)性的親屬中，發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎的危險(xiǎn)性達(dá)20%。,自身免疫病的基本特征,系統(tǒng)性紅斑

5、狼瘡（SLE）的家族發(fā)病率也較高，在SLE第一代親屬中發(fā)病率達(dá)3%--5%，同胞姐妹發(fā)病率更高，特別是單卵雙胎更為常見(jiàn) 。在1980年的調(diào)查中35組單卵雙胎的患者中，有22組患SLE，共患病率達(dá)62.9%，而雙卵雙胎8組中僅1組患病，為12.5%。,自身免疫病的基本特征,性別差異和年齡大?。?強(qiáng)直性脊柱炎（AS）多見(jiàn)于年輕男性，其發(fā)病年齡從4---90歲不等，但以15---20歲多見(jiàn)，男女比列為9--10:1，但最

6、近有人調(diào)查發(fā)現(xiàn)男女比列約為1.5--3:1，只不過(guò)女性 強(qiáng)直性脊柱炎患者起病緩慢，病情較輕，易被誤診。,自身免疫病的基本特征,系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是最常見(jiàn)的自身免疫性疾病之一，發(fā)病的男女比列為1:9，在生肓年齡甚至可高達(dá)1:30，而且多發(fā)生于20--40歲的孕齡婦女。,自身免疫病的基本特征,大多數(shù)自身免疫病呈現(xiàn)出發(fā)作——緩解——復(fù)發(fā)——緩解——遷延的臨床特征，以致成為終身痼疾。,自身免疫病的基本特征,免疫抑制劑（腎上腺皮質(zhì)激素、環(huán)磷

7、酰胺）治療有一定療效，但副作用與不良反應(yīng)嚴(yán)重，停藥后常易復(fù)發(fā)。,自身免疫性疾病臨床“病譜”,器官特異性 非器官特異性橋本甲狀腺炎 類天皰瘡 自身免疫性腎小球腎炎 系統(tǒng)性紅斑狼瘡原發(fā)性粘液水腫 惡性貧血 肺

8、腎出血綜合征 干燥綜合征甲狀腺機(jī)能亢進(jìn) 自身免疫性萎縮性胃炎 絕經(jīng)過(guò)早（少數(shù)病例） 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Addisino病 自身免疫性肝炎 男性不育（少數(shù)病例） 硬皮病1型糖尿病 原發(fā)性膽汁性肝硬化 潰瘍性結(jié)腸炎 多發(fā)性肌炎/皮肌炎重癥肌無(wú)力

9、 原發(fā)性硬化性膽管炎 克隆氏病 混合性結(jié)締組織病多發(fā)性硬化癥 自身免疫性溶血性貧血 交感性眼炎 系統(tǒng)性血管炎脫髓鞘疾病 特發(fā)性血小板減少性紫癜 晶狀體源性葡萄膜炎 抗磷脂綜合征尋常天皰瘡 特發(fā)性粒細(xì)胞減少癥

10、 藥物性狼瘡自身免疫性疾病有一百多種，發(fā)病率占世界人口的10%自身免疫性疾病幾乎遍布臨床各科（非手術(shù)科）? 疑難病癥？,常見(jiàn)的自身免疫性疾病圖片資料,系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）,常見(jiàn)的自身免疫性疾病圖片資料,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）,常見(jiàn)的自身免疫性疾病圖片資料,系統(tǒng)性硬化癥（PSS）,常見(jiàn)的自身免疫性疾病圖片資料,干燥綜合癥（SS）,常見(jiàn)的自身免疫性疾病圖片資

11、料,皮肌炎/多發(fā)性肌炎（DM/PM）,自身抗體的檢測(cè),自身抗體：是指抗自身細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞表面和細(xì)胞外抗原的免疫球蛋白。,自身抗體的檢測(cè),自身抗體是自身免疫病的重要標(biāo)記，每種自身免疫病都伴有特征性的自身抗體，某些自身抗體因?qū)膊〉脑\斷具有高度的特異性，已成為診斷某些疾病的血清標(biāo)記性抗體或特異性抗體，某些自身抗體與疾病的活動(dòng)性有相關(guān)性，個(gè)別的自身抗體被證實(shí)參與了組織的免疫病理?yè)p傷。,自身抗體的檢測(cè),自身抗體檢測(cè)的臨床意義有助于自身免疫

12、病的早期診斷；有助于判斷疾病的活動(dòng)性和預(yù)后，觀察治療反應(yīng)，指導(dǎo)臨床用藥；有助于進(jìn)一步研究和闡明自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。,自身抗體的檢測(cè)方法,間接熒光染色技術(shù)（IIF）實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞、組織切片或純化的、生化性質(zhì)明確的物質(zhì)均可作為檢測(cè)自身抗體或病原體抗體的抗原基質(zhì)。如標(biāo)本為陽(yáng)性，已稀釋血清中的特異性抗體將與包被在固相上的抗原結(jié)合。第二步，已結(jié)合的抗體與熒光素標(biāo)記的抗人抗體結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。,自身抗體的檢測(cè)方法,間接

13、熒光染色技術(shù)（IIF）,自身抗體的檢測(cè)方法,間接熒光染色技術(shù)（IIF）特異性高：陰陽(yáng)性結(jié)果的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比明顯。每種已結(jié)合的抗體在相應(yīng)抗原的位置產(chǎn)生典型的熒光模型?；|(zhì)中抗原譜完整，可檢測(cè)多種抗體，并且檢出率高。當(dāng)制備酶免試劑所需要的抗原太困難或復(fù)雜時(shí)，可選擇間接免疫熒光法。,自身抗體的檢測(cè)方法,核均質(zhì)型：ds-DNA或抗組蛋白？,,自身抗體的檢測(cè)方法,斑點(diǎn)型（S）：抗SSA、抗SSB？,,自身抗體的檢測(cè)方法,著絲點(diǎn)型（ACA）：抗

14、著絲點(diǎn)抗體。,自身抗體的檢測(cè)方法,抗紡錘體抗體,,自身抗體的檢測(cè)方法,ELISA法檢測(cè)ANA[原理]：利用ELISA法，搜集細(xì)胞核和細(xì)胞漿抗原，如ds-DNA、Histones、Sm、RNP、SSA、SSB、Scl-70、centromere、Jo-1等混合液包被微孔板，檢測(cè)抗核抗體。,自身抗體的檢測(cè)方法,ELISA法與IIF法比較，有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀，無(wú)需熒光顯微鏡等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在一些醫(yī)院用ELISA法來(lái)作檢測(cè)ANA的篩選方法。

15、,自身抗體的檢測(cè)方法,顆粒凝集法(PA）[原理]：以檢測(cè)抗脫氧核糖核蛋白體（抗DNP抗體）為例。從小牛胸腺中提取脫氧核糖核蛋白(DNP）抗原，致敏聚苯乙烯乳膠，制成抗DNP抗體乳膠凝集試劑，當(dāng)血清中存在抗DNP抗體時(shí)，便與乳膠顆粒上的DNP抗原結(jié)合，使乳膠顆粒相互凝集出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒。,自身抗體的檢測(cè)方法,金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法[原理]：斑點(diǎn)反應(yīng)板上固相純化抗原與血清中抗體形成復(fù)合物，膠體金標(biāo)記抗人IgG單抗與復(fù)合物結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)

16、的紅色圓斑點(diǎn)。本法用于快速檢測(cè)血清中抗體。,自身抗體的檢測(cè)方法,免疫印跡法(IB）：[原理]：用SOS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將抗原按分子量大小予以分離，再將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜，如果受檢血清含有相應(yīng)抗原的自身抗體，則在相應(yīng)位置會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，再加酶標(biāo)抗體，底物，顯色液和終止液，在抗原抗體反應(yīng)的位置出現(xiàn)顯色帶，與標(biāo)準(zhǔn)帶相比較。,自身抗體的檢測(cè)方法,免疫印跡法(IB）：,自身免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查,血常規(guī)：RA：80%貧血，活動(dòng)期PLT升

17、高。 SLE：WBC，PLT，Hb均可能降底。免疫血管炎：WBC增高。對(duì)藥物引起的骨髓抑制的監(jiān)測(cè)。,自身免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查,尿常規(guī)：SLE：尿蛋白及RBC的出現(xiàn)表明腎臟損傷。,自身免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查,肝功能：如有異常，應(yīng)鑒別是何種性質(zhì)（自身免疫肝??？）病原感染常規(guī)檢查肝炎病毒：HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV……EBV,TB……,自身免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查,腎功能：免疫腎?。⊿LE？血管炎？）肌酶：多發(fā)性

18、肌炎/皮肌炎（PM/DM）尿酸：痛風(fēng)？,自身免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查,免疫血清學(xué)檢查免疫球蛋白、血清蛋白電泳（高球蛋的血癥）。ESR、CRP（急性期蛋白）：對(duì)病情活動(dòng)性的判斷。CH50、C3、C4：SLE活動(dòng)期均降底。ASO：鏈球菌感染，風(fēng)濕熱。,自身免疫病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查,抗核抗體譜（ANAs）抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCAs）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)抗體自身免疫性肝病相關(guān)抗體抗磷脂抗體其它……,抗核抗體譜(ANAS）的檢測(cè),抗

19、核抗體(ANA）是自身抗體中的一組抗體。ANA的研究，從發(fā)現(xiàn)狼瘡(LE）細(xì)胞算起，迄今40多年來(lái)，人們對(duì)ANA的認(rèn)識(shí)不斷加深，已衍生出具有不同臨床意義的二十余種ANA，形成了抗核抗體譜(ANAS）。,抗核抗體譜(ANAS）的檢測(cè),抗核抗體：傳統(tǒng)定義：顧名思義是指抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的總稱。現(xiàn)代定義：是指抗細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱。,抗核抗體譜(ANAS）的檢測(cè),ANA檢測(cè)—IIF法(金標(biāo)準(zhǔn)) 1、90%以上實(shí)驗(yàn)

20、室使用Hep-2細(xì)胞為底物; 2、為人來(lái)源培養(yǎng)細(xì)胞（人喉癌細(xì)胞），據(jù)有核大、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰特點(diǎn)； 3、便于結(jié)構(gòu)觀察及熒光染色核型分析； 4、 核抗原豐富、特異性強(qiáng)、有完整的ANA抗原譜(細(xì)胞核、漿、骨架、周期）； 5、可預(yù)測(cè)分析ANA靶抗原范圍； 6、 經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)。,IIF法檢測(cè)ANA陽(yáng)性常見(jiàn)熒光染色模型細(xì)胞核 細(xì)胞漿 細(xì)胞骨架 細(xì)胞周期均質(zhì)型 核糖體型 肌動(dòng)蛋白型 中

21、心體型核膜型 線粒體型 波形蛋白型 紡錘體型斑點(diǎn)型 高爾基體 中間體型核仁型 溶酶體型著絲點(diǎn) 顆粒型（粗、細(xì)）PCNA型核（多、少）點(diǎn)型,,抗核抗體譜(ANAS）的檢測(cè),在實(shí)際工作中，不管用何種方法來(lái)檢測(cè)ANA，實(shí)際上都是指總抗核抗體檢測(cè)。若檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則需進(jìn)行分型。,抗核抗體譜(ANAS）的檢測(cè),抗核抗體(ANA)的陽(yáng)性率SLE

22、 >95%PSS 70-80%MCTD >95%SS

23、 60-70%PM/DM 50-60%RA 20-30%自身免疫性肝炎 80-90%正常人 5-2

24、0%,IIF法檢測(cè)ANA陽(yáng)性常見(jiàn)熒光染色模型細(xì)胞核 細(xì)胞漿 細(xì)胞骨架 細(xì)胞周期均質(zhì)型 核糖體型 肌動(dòng)蛋白型 中心體型核膜型 線粒體型 波形蛋白型 紡錘體型斑點(diǎn)型 高爾基體 中間體型核仁型 溶酶體型著絲點(diǎn) 顆粒型（粗、細(xì)）PCNA型核（多、少）點(diǎn)型,,抗心磷脂抗體（ACL）,抗心磷脂抗體（Anti

25、-Cardiolipin Antibodies ACL）是抗磷脂抗體中的一個(gè)重要組成部分，可在多種結(jié)締組織病中出現(xiàn)，抗心磷脂抗體可分為IgA、 IgM、IgG。,抗心磷脂抗體（ACL）,研究表明ACL在SLE中陽(yáng)性率為30%，其次在RA中陽(yáng)性率為23%，都以IgG型為主。在SLE病人當(dāng)中ACL陽(yáng)性者狼瘡腦病的發(fā)病率明顯高于ACL陰性患者，另外，血小板減少，血管栓塞和習(xí)慣性流產(chǎn)也與ACL抗體密切相關(guān)。,抗心磷脂抗體（ACL）,,類風(fēng)濕

26、性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,類風(fēng)濕因子（Rheumatoid Factor RF）是IgGFc端的自身抗體，因?yàn)樗强贵w（即IgG）的對(duì)應(yīng)抗體，故也稱為抗抗體。RF可以是IgG、IgA、IgM型，現(xiàn)在一般說(shuō)的RF是指IgM類風(fēng)濕因子。,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,RF出現(xiàn)于的RA病人血清中，約30%的SLE、約50%的SS，部分MCTD和少數(shù)PSS病人也可呈陽(yáng)性，在某些病毒、原蟲(chóng)、細(xì)菌感染和腫瘤等非自身免疫病患者也可以出現(xiàn)。,類

27、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,RA是一種最常見(jiàn)的自身免疫性疾病，在全世界大約有1%的人患有此病。是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥的慢性自身免疫性疾病，其預(yù)后變異大，輕者發(fā)生輕度關(guān)節(jié)畸形，重者則發(fā)生嚴(yán)重致死性病變。RA診斷和治療晚，則療效不滿意。早期診斷和治療，炎癥有可能發(fā)生可逆性改變，這就顯得RA的早期診斷極為重要。,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,類風(fēng)濕因子（RF）： 陽(yáng)性率為79%，特異性為63%?？购酥芤蜃涌贵w（APF) ： 陽(yáng)性率達(dá)為

28、81%，特異性為73-90%?？菇琴|(zhì)蛋白抗體（AKA）： 陽(yáng)性率為36-69%，特異性為95-99%?？筊A33抗體： 陽(yáng)性率為35%，病情相對(duì)較重。,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,抗Sa抗體：IB法檢測(cè)的敏感性為40%，特異性為99%，陽(yáng)性預(yù)報(bào)率為98%。,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體：一種遠(yuǎn)比類風(fēng)濕因子特異的RA的指標(biāo)?？笴CP陽(yáng)性患者比陰性的患者更容易發(fā)展成可通過(guò)放射性方法檢測(cè)到的關(guān)節(jié)

29、損傷。ELISA法敏感性為80%，特異性為96%。在79%的早期患者中可檢出抗CCP抗體。,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的早期診斷,這幾種抗體都可以在RA起病一年內(nèi)出現(xiàn)，除RF外的幾種抗體對(duì)RA的診斷具有很高的特異性，故對(duì)RA的早期診斷有很大的幫助。,抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體譜（ANCA）,ANCA是一種以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體。80年代中期發(fā)現(xiàn)ANCA，是臨床診斷原發(fā)小血管炎的重要血清學(xué)標(biāo)志。近10年來(lái)國(guó)際上對(duì)ANC

30、A的研究進(jìn)入了高潮，重要的ANCA抗原相繼發(fā)現(xiàn)。,抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體譜（ANCA）,ANCA靶抗原包括：蛋白酶3（PR3）髓過(guò)氧化物酶（MPO）人白細(xì)胞彈性a蛋白酶（HEL）乳鐵蛋白（LF）組織蛋白酶G（CG）人溶酶體相關(guān)膜蛋白2（H-LAMP2）,抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體譜（ANCA）,溶菌酶（LYS）殺菌/膜通透性增高蛋白（BPI）天青殺素防御素α -浠醇酶β-葡萄糖醛酸酶,抗線粒體抗體（antimitochon

31、drial antibodies　AMA） AMA是一種無(wú)種屬特異性和器官特異性的自身抗體。1965年WalRer等首先應(yīng)用間接免疫熒光法（IIF）發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁肝硬化（PBC）患者血清中存在AMA。其后研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者的AMA陽(yáng)性率可高達(dá)90%，此項(xiàng)已成為PBC診斷的主要檢查項(xiàng)目。,AMA迄今發(fā)現(xiàn)的亞型共有9種（M1-M9），其中與PBC相關(guān)的有4種，即抗M2、M4、M8、M9。抗M2被認(rèn)為是PBC敏感特異的

32、診斷標(biāo)志性抗體。M2靶抗原的主要成分為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2組分。高滴度的AMA-M2在PBC中陽(yáng)性率大于96%，對(duì)PBC的診斷及鑒別有很高的特異性。,間接免疫熒光（IIF）是檢測(cè)ANCA最早采用的方法，應(yīng)用灑精固定的白細(xì)胞制備的抗原底物片，主要表現(xiàn)為兩種陽(yáng)性熒光染色型。,胞漿型ANCA（c-ANCA）：中性粒細(xì)胞胞漿彌漫性顆粒樣染色，并在核葉之間有重染者稱之。其靶抗原主要是蛋白酶3（PR3），存在于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中，約占c-AN

33、CA的80-90%。,PR3-ANCA在臨床上與韋格納氏肉芽腫（WG）密切相關(guān)，c-ANCA診斷WG的特異性大于90%。PR3-ANCA在其它原發(fā)性血管炎中也可被檢測(cè)到，如顯微鏡下多血管炎（MPA）、壞死性新月體型腎小腎炎（NCGN）、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎（PAN）。,核周型ANCA（p-ANCA）：中性粒細(xì)胞核周圍發(fā)熒光者稱之。其靶抗原主要是髓過(guò)氧化物酶（MPO），存在于中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中，資料顯示MPO-ANCA參與血管炎相關(guān)疾病的