徐元宏加強微生物監(jiān)測提高抗感染治療水平研究生

1、一、正確留取標本是獲得準確結果的前提,1.血液、骨髓、無菌體液：（1）嚴格消毒、避免體表正常菌群的污染。（2）應在抗生素使用之前抽血。如果病人已使用抗生素，應選擇含中和劑（活性炭、中性樹脂）的培養(yǎng)瓶，或在下次用藥前采血。（3）由于血液、骨髓、無菌體液含有極少量的病原體，就可以造成感染性疾病，而實驗室檢出率與病原體數量有關，并非只要有病原體就能檢驗出來，因此血液、骨髓、無菌體液等必須增菌才能獲得滿意結果。成人未使用抗生素治療采集骨髓

2、0.5-1毫升，血液、胸腹水、關節(jié)液3-10毫升接種成人培養(yǎng)瓶（藍蓋）；成人已使用抗生素治療采集上述標本接種加中性樹脂培養(yǎng)瓶（灰蓋）；兒童采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水，關節(jié)液1-3毫升接種兒童培養(yǎng)瓶（紅蓋）；厭氧培養(yǎng)接種上述標本3-10毫升于厭氧培養(yǎng)瓶（黃蓋）。（4）由于菌血癥、敗血癥是間歇排菌，應在發(fā)熱高峰時采血，對于感染性心內膜炎患者增加采血次數，以提高陽性率。,,,,,,,,,,2.導管相關性的血流感染（CRBSI）血培

3、養(yǎng)（1）第一采集方法經外周靜脈穿刺采血》1套（送兩個培養(yǎng)瓶）；從導管中心或靜脈留置口隔膜采血1套，兩者的采血時間應該接近（《5分鐘）。,結果解釋：（a）依據細菌鑒定和藥敏試驗確認，若兩套陽性血培養(yǎng)是同一種細菌，又沒有其它部位的感染，提示CRBSI；（b）若兩套陽性血培養(yǎng)瓶是同一種細菌，從導管采血血培養(yǎng)報告陽性時間比外周靜脈穿刺采血早》120分鐘，又沒有其它部位的感染，提示CRBSI；,（c) 依據細菌鑒定和藥敏試驗確認，若兩套

4、陽性血培養(yǎng)是同一種細菌，又沒有其它部位的感染，從導管采血血培養(yǎng)報告陽性時間比外周靜脈穿刺采血不足120分鐘，提示CRBSI；（d）若外周靜脈穿刺采血血培養(yǎng)是陰性，只有導管采血的血培養(yǎng)是陽性，不能定為CRBSI；,（e）若只有外周靜脈穿刺采血的血培養(yǎng)是陽性，但分離菌為金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位感染的證據，提示高度可疑為CRBSI；（f）若再次導管采血/外周采血，若培養(yǎng)陽性，且是同一種細菌，可定為CRBSI；,（2）第

5、二種采集方法： 外周靜脈穿刺采血采集1～2套，同時拔出導管，用Maki導管平皿滾動法，對導管尖片段進行半定量培養(yǎng)。,結果解釋：（a）如果兩套外周靜脈穿刺采血培養(yǎng)是陽性，導管片段培養(yǎng)為陽性（》15CFU/平皿），提示為CRBSI；（b）如果兩套外周靜脈穿刺采血培養(yǎng)是陰性，導管片段培養(yǎng)為陽性，提示可能為導管上的定植菌，不支持CRBSI；,（c）若所有的血培養(yǎng)和導管片段培養(yǎng)是陰性，不太可能是CRBSI；（d）如果有》1套的血培

6、養(yǎng)是陽性，導管片段的培養(yǎng)是陰性，但分離株是金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位的感染證據，提示仍有可能是CRBSI。,3.尿液：（1）導尿法：是一種較好的無菌采集法，主要適用于手術后患者，取10-15毫升尿液于無菌容器內送檢，但留置導尿管易造成醫(yī)院內感染。（2）中段尿采集法：是臨床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及陰道口；男性病人應翻轉包皮沖洗，用1：1000新潔爾滅消毒尿道口，在用無菌

7、紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，收集中段尿10—20ml，盛于無菌容器內，立即加蓋送檢。,（3）腎盂尿采集法：為確定菌尿是否來自腎臟，可用導尿管采集腎盂尿。首先充分沖洗膀胱，以最后一次沖洗尿作對照，后用導尿管插入輸尿管，分別標記左右側，收集3次尿；如果輸尿管菌數比對照尿菌數多或第3次尿中菌數比第1次多，該菌尿可能來自腎臟。反之，如果第1次尿菌數多于第3次尿菌數，則可能來自膀胱。腎盂尿采集法一般應該請泌尿科醫(yī)師協(xié)助進行，并確實做好標記，

8、以防左右側搞錯。,（4）膀胱穿刺尿采集法：將病人恥骨上皮膚碘酒、酒精消毒后，以無菌針筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厭氧菌的培養(yǎng)，故在取得尿液后，針頭插于橡皮塞上送檢。當兒童或嬰兒采集中段尿困難或培養(yǎng)結果與患者病情有矛盾時，可考慮用此法采集尿液。（5）留尿法：尿液檢查結核分枝桿菌時，可用一潔凈容器，留取24h的尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清潔瓶內送檢。實驗室人員接受后應全部離心，涂片鏡檢。,4.痰液：正常人下呼吸道是無菌的

9、，上呼吸道有正常菌群寄居。下呼吸道的分泌物必須通過上呼吸道，常受上呼吸道的正常菌群的污染。因此對于下呼吸道分泌物培養(yǎng)出來的結果必須分析、判斷。一般要求病人清晨用無菌生理鹽水漱口6次，再用冷開水漱口一次，用力咳深部的痰液于無菌容器內送檢，避免口水的污染。對于痰液不能自主咳出，可采用高滲鹽水霧化吸入排痰。,實驗室在收到痰標本，涂片革蘭染色（SEC25/LPF）可做細菌培養(yǎng)，記錄涂片結果，SEC>25/LPF，WBC<10/LPF

10、，視為污染，建議重留標本；介于二者之間做細菌培養(yǎng)，記錄涂片結果，結合培養(yǎng)后細菌數量考慮是否是致病菌。合格的痰標本用無菌生理鹽水約20毫升漂洗2次，用等量的sputosol作用20分鐘。用接種環(huán)四區(qū)劃線，從一區(qū)到另一區(qū)應滅菌，接種直徑9厘米的血平板兩塊，巧克力平板一塊，沙包氏培養(yǎng)基。,置CO2環(huán)境下培養(yǎng)。從采集標本到接種應在2小時內完成。未發(fā)現(xiàn)致病菌，再培養(yǎng)72小時。 若懷疑結核感染找抗酸桿菌，應收集24小時的痰液于清潔玻璃容器內。若懷

11、疑放線菌感染，應讓病人留取含有顆粒的痰液，實驗室查到硫磺顆粒且弱抗酸，可以考慮放線菌 感染。若懷疑口腔正常菌群紊亂或口腔霉菌感染，可以用無菌棉簽取咽峽部分泌物于無菌容器內送檢。,5.皮膚、創(chuàng)面：首先按常規(guī)消毒皮膚，然后用無菌注射器抽吸皮下病變部分，或用無菌棉簽取痂下膿性分泌物。6.生殖道分泌物：根據病人主述臨床癥狀，采用不同方式取材：若病人白帶呈淡黃色，稀水樣，考慮滴蟲感染，用無菌棉簽取陰道分泌物于1毫升生理鹽水內送檢，注意保溫，因

12、為目前滴蟲的檢驗主要看鞭毛擺動的動力。若病人白帶呈“豆腐渣”樣，燒癢癥狀，用無菌棉簽取“豆腐渣”樣白帶送檢，選擇不同的送檢方式和檢驗方法可獲得不同的檢驗結果，其方法有生理鹽水直接鏡檢、涂片加NaOH破壞上皮細胞鏡檢、革蘭染色鏡檢，一般認為革蘭染色鏡檢是較為理想的方法。,對于口腔、陰道等部位由于采用染色方法提高酵母菌檢驗靈敏度，對于是定植還是致病，目前缺少診斷依據。若懷疑淋病患者，對于男性急性患者，用一支棉簽檫去尿道口膿液，輕輕擠壓尿道

13、口，再用一支棉簽取其膿液；對于男性慢性患者或治療后復查的患者，用一支棉簽伸入尿道口2-4厘米，停留數秒鐘，旋轉取出，因為尿道口寄居的是鱗狀上皮細胞，尿道 2-4厘米寄居的是柱狀上皮細胞，這是淋球菌寄居的地方。 對于女性患者，用溫水濕潤的擴陰器，取陰道分泌物或宮頸分泌物，棉簽停留數秒鐘，讓棉簽充分吸附分泌物。從直腸取材時，應將棉簽插入肛門2.5厘米以上，碰到糞便，應換一個棉簽重取。檢查淋球菌性咽炎時，應從扁桃體及扁桃體窩取材。,支原體檢查

14、：支原體是簡單的原核細胞，沒有細胞壁，缺乏許多細胞器，直接鏡檢沒有意義，只有通過培養(yǎng)，取材顯得重要，采集標本時，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培養(yǎng)，女性推薦陰道拭子。衣原體檢查：采取尿道標本，至少在排尿1小時后采集，對于男性尿道取材，棉拭子應伸入尿道2-4厘米（因為衣原體寄生在粘膜柱狀上皮細胞，而不是寄生在復層鱗狀上皮細胞中），轉動拭子以獲得細胞；對于女性尿道取材，先用一個拭子擦凈尿道口，再用棉拭子,（?。┥烊肽虻?厘米，輕輕轉動拭

15、子取出，對于女性宮頸取材，用溫水濕潤的擴陰器擴張陰道，先用一個拭子擦凈宮頸口，然后再用棉拭子（小）伸入宮頸內1-2厘米，用力摩擦采取宮頸細胞，不采用膿液作培養(yǎng)。直腸取材，可將拭子插入肛門括約肌，在肛門和直腸結合處沿腸壁轉動，持續(xù)10-30秒，以吸取微生物，并避免糞便的污染。尿液、精液、服過抗生素的病人標本以及新近用過某些陰道制劑、清潔劑等病人標本不宜作衣原體檢查。,二、正確檢驗病原體,1.及時接種，選擇合適培養(yǎng)基：由于體外環(huán)境不是

16、微生物生長的最適宜環(huán)境，微生物怕冷、熱、光、干燥、消毒劑，因此實驗室接受標本后，應立即接種；不同微生物需要不同的營養(yǎng)要求和環(huán)境，選用不同的培養(yǎng)基，制備不同的環(huán)境，例如解脲支原體需要解脲支原體培養(yǎng)基，腦膜炎奈瑟氏菌需要營養(yǎng)豐富的巧克力血平板和5-10%CO2，淋球菌需要Thayer-Martin（T-M）、NYC培養(yǎng)基和5-10%CO2。除此之外，為了更好分離致病菌、抑制正常菌群和污染菌，需要加入一些營養(yǎng)因子和抑菌劑。例如淋球菌T-M培養(yǎng)

17、加入血紅蛋白、萬古霉素、多粘菌素、制霉菌素、磺胺嘧啶。萬古霉素抑制葡萄球菌的生長，多粘菌素抑制銅綠假單胞菌的生長，制霉菌素抑制念珠菌的生長，磺胺嘧啶抑制變形桿菌的生長。有利的一面，利于淋球菌的的識別；不利的一面是遺漏可能的致病菌，患者易產生繼發(fā)感染：繼發(fā)霉菌性陰道炎、淋病治愈后葡萄球菌性尿道炎。,2.如何將含量少的病原體檢驗出來？及時接種，避免微生物的死亡。某些感染必須增菌，以獲得足夠數量的病原體，血液、骨髓、胸水、腹水、腦脊液、關

18、節(jié)液等必須接種到增菌培養(yǎng)基上。選用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基、提供適宜的環(huán)境，滿足不同病原體的要求。采用靈敏的方法檢測病原體。,3.如何從眾多的正常菌群中辨別致病菌？采用 營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基和適宜的環(huán)境滿足致病菌的生長。采用含抑制劑的培養(yǎng)基篩選致病菌。如解脲支原體培養(yǎng)基除含小牛血清外，還含有青霉素；分離大腸埃希氏菌O157，H7所用培養(yǎng)基是山梨醇麥康凱培養(yǎng)基。運用豐富、扎實的知識識別致病菌。對于痰液：致病菌是腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、

19、肺炎鏈球菌、奴卡菌；可能致病菌是念珠菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌（指除凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌之外的所有凝固酶陰性葡萄球菌統(tǒng)稱，目前包括31個種，是一種習慣稱法）、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他粘膜炎奈瑟菌等。,一般不是致病菌是指草綠色鏈球菌。 對于尿液：分離到兩種以下的細菌，可能是病人寄居的細菌，若分離到三種或三種以上，可能是污染菌，建議病人重新留取標本。在報告細菌的同時，應報告菌落計數，過去認為對于革蘭陰性桿菌≥10

20、5 CFU/ml有致病意義，革蘭陽性球菌≥104 CFU/ml有致病意義；現(xiàn)在認為只要病人有主述癥狀，菌落計數≥100 CFU/ml就有致病意義。,4.正確認識菌體形態(tài)和菌落形態(tài)通過革蘭染色將細菌分為：革蘭陽性桿菌、革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌、革蘭陰性球菌。由于該法簡單、迅速，廣泛用于微生物檢驗。在無菌部位出現(xiàn)相應細菌，幫助我們用藥，在有菌部位，幫助我們分析是否菌群紊亂。通過抗酸染色將細菌分為：抗酸桿菌和非抗酸桿菌，對于通過痰液排菌

21、的肺結核患者、皮膚麻風患者、結核性腦膜炎患者有較大的幫助。,通過墨汁染色可以直接判斷有無新型隱球菌感染。菌落特征有突起、凹陷、色澤、色素等表面特征：肺炎鏈球菌呈現(xiàn)肚臍樣凹陷，沙雷氏菌出現(xiàn)紅色色素，銅綠假單胞菌有綠色、無色色素，有姜味氣味，可呈現(xiàn)粘液型菌落、粗糙型菌落、光滑型菌落。,5.正確鑒別病原菌 對于細菌而言，主要依據表型特征，菌體、菌落形態(tài)，溶血性、生化反應，血清凝集將細菌鑒定。革蘭陽性球菌中葡萄球菌主要依據凝固酶、新生霉素抑

22、菌試驗、生化反應來判斷；腸球菌依據6.5%NaCL、膽汁七葉苷與葡萄球菌、鏈球菌鑒別，依據甘露醇、 山梨醇、山梨糖、精氨酸、阿拉伯糖、棉子糖 、動 力、黃色素、蔗糖、丙酮酸鹽來鑒別屬內12個種；鏈球菌屬依據cAMP、DNA、桿菌肽、血清凝集來鑒別。,革蘭陰性球菌主要依據氧化酶、DNA酶、生化反應來鑒別，淋球菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陰性、甘露糖陰性、蔗糖陰性；腦膜炎奈瑟氏菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖

23、陽性、乳糖陰性、麥芽糖陽性、甘露糖陰性、蔗糖陰性。革蘭陽性桿菌主要依據菌體、菌落，特征性染色來鑒別，結核分枝桿菌抗酸染色陽性，白喉棒狀桿菌Albert染色出現(xiàn)異染顆粒，產單核李斯特菌溶血性和動力。革蘭陰性桿菌主要依據氧化酶、氧化-發(fā)酵（O-F）試驗來判斷。,氧化酶陰性、氧化-發(fā)酵（O-F） 發(fā)酵 腸桿菌科編碼 補充生化反應鑒定到種。對于致病性大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌還需血清學凝集。,,,,氧化酶陰性

24、、氧化-發(fā)酵（O-F） 氧化 非發(fā)酵菌編碼氧化酶陽性、氧化-發(fā)酵（O-F） 氧化/- 補充生化反應鑒定到種。氧化酶陽性、氧化-發(fā)酵（O-F）發(fā)酵 弧菌科編碼 補充

25、生化反應、血清學凝集鑒定到種，如霍亂弧菌O1、O139等。對于真菌而言，主要依據菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、色素， 同化試驗、發(fā)酵試驗來鑒別至種屬。實驗室人員困惑：由于上述細菌、真菌鑒定依靠表型特征，表型是受基因控制，同一基因型可能有不同種表型，同一表現(xiàn)型可能受不同基因型所控制。根據表現(xiàn)型判斷的菌體能代表真正的菌屬嗎？隨著分子生物學的發(fā)展，人們能任意改造表現(xiàn)型。我們能有所作為嗎？,,,,,,,,三、恰如其分報告藥敏結果,藥敏試驗中藥敏紙片

26、選用：臨床醫(yī)生經常反映，實驗室所報告的藥敏試驗結果，臨床根本或很少使用這類藥物，實驗室藥敏試驗中藥物是敏感，臨床使用無效。如何聯(lián)合用藥、合理用藥？實驗室人員應根據可能的細菌種類、細菌的菌屬，合理選用藥敏紙片，報告檢驗結果。實驗室應根據美國FDA推薦臨床微生物實驗室苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌分組的藥物選用，它將藥物分為四組：A組，一級試驗并常規(guī)報告的抗生素 ；B組，一級有選擇報告的抗生素 ；C組，補充試驗，有選擇報告的抗生素 ；U組，用于泌尿道補充

27、試驗的藥物。,例如對于腸桿菌科細菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素；選擇報告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢孟多或頭孢尼西或頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢噻肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、環(huán)丙沙星或左氧氟沙星、亞胺培南或美羅培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。,對于銅綠假單胞菌和不動桿菌常規(guī)報告的抗生素有

28、頭孢他啶、慶大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，選擇報告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南或美羅培南、妥布霉素。對于葡萄球菌常規(guī)報告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，選擇報告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、萬古霉素。,對于腸球菌常規(guī)報告的抗生素有青霉素/氨芐西林 ，選擇報告的抗生素有萬古霉素 。對于嗜血桿菌常規(guī)報告的抗生素有氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報告的

29、抗生素有頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢呋辛鈉（針劑）、氯霉素、美羅培南。,對于肺炎鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、萬古霉素。對于除肺炎鏈球菌以外其它鏈球菌常規(guī)報告的抗生素有紅霉素、青霉素、氨芐西林，選擇報告的抗生素有氯霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢吡肟或頭孢他啶或頭孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezoli

30、d、奎奴普汀/達福普汀。,對于淋球菌常規(guī)報告β-內酰胺酶結果，如β-內酰胺酶陽性提示青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥，但淋球菌更多的是染色體介導的耐藥，需要做補充藥敏試驗，選擇報告的抗生素有頭孢克肟或頭孢噻肟或頭孢泊肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素。,遵循嚴格的操作方法、施加質量控制：紙片擴散法（K-B））法、液體稀釋法必須遵循NCCLS（CLSI）規(guī)

31、定，它對紙片厚度、藥物濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、孵育溫度、操作方法都有詳細規(guī)定。E-test必須按照其說明要求進行。運用豐富的理論知識，提示臨床用藥：對于腸道分離的沙門菌和志賀菌屬，常規(guī)僅測試氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和TMP/SMZ藥物，1、2代頭孢菌素盡管體外敏感，但臨床治療無效，實驗室不能做此藥敏試驗。對于腸道外分離株，沙門氏菌屬還一定要測試并報告氯霉素和某一種三代頭孢菌素。,對于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐慶大霉素腸

32、球菌、AmpC- β-內酰胺酶應有所選擇性報告藥敏結果，有時體外藥敏結果是敏感的也要報告耐藥。,1.藥敏試驗種類和方法：（1）細菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法,（2）酵母樣真菌藥敏試驗紙片擴散法液體稀釋法E-test法淺部真菌目前尚沒有標準方法。,細菌藥敏試驗-紙片擴散法,Kirby-Bauer agar disk diffusionPaper disk containing antibiotic is

33、placed on lawn of bacteria, then incubated overnight. Diameter of zone of inhibition is inversely related to MIC (used to establish interpretive breakpoints).Standardized for commonly isolated, rapidly growing organisms

34、.,,細菌藥敏試驗-液體稀釋法,Minimal inhibitory concentration (MIC)Reference method. Add standard inoculum to dilutions of antibiotic. Incubate overnight. MIC is lowest concentration that inhibits growth (can also be performed by ag

35、ar dilution). Interpretation (S or R) is based on achievable drug levels,細菌藥敏試驗- E-test法,E-testStrips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at poin

36、t where zone of inhibition intersects scale on strip.Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.,醫(yī)院內感染菌常常是一些耐藥菌，實驗室應對這些細菌的耐藥表型進行檢測。腸桿菌科（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、變形桿菌）應作超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林

37、的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽類抗生素的腸球菌（VRE）。,,四、耐藥表型的檢測,1、甲氧西林葡萄球菌的檢測：MRSA(Methicillin-resistant Staphylococus aureus) 、MRSCON（Methicillin-resistant coagulatase-negative Staphylococcal species）檢驗：,（1）．紙片擴散（K-B）法由于苯唑青霉素較甲氧西林青霉素穩(wěn)定，不易失活，

38、通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素測定葡萄球菌。M-H瓊脂平板，直接菌落懸液法，苯唑青霉素紙片含量為1μ g/片，35℃24小時孵育，抑菌圈直徑《10mm。2004年NCCLS推薦耐甲氧西林葡萄球菌評判標準:采用頭孢西丁紙片（30μ g）, 孵育24小時,對于金黃色葡萄球菌抑菌圈≤21mm為MRSA，≥22mm為MSSA;對于凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈≤24mm為MRSCON，≥25mm為MSSCON.,(2).瓊脂稀釋法篩選試驗：

39、苯唑青霉素耐藥培養(yǎng)基：含NaCL的M-H瓊脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6μg /ml苯唑青霉素或10μ g/ml甲氧西林接種：直接菌落懸液約0.5麥氏比濁管，用拭子浸潤菌懸液后，在平板表面點種或劃線。培養(yǎng)條件：35℃空氣培養(yǎng)時間：24小時，對于甲氧西林/苯唑青霉素耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌，孵育48小時后再檢測最可靠。結果：>1菌落=耐藥推薦質控菌：金黃色葡萄球菌ATCC29213—敏感，金黃色葡萄

40、球菌ATCC43300-耐藥,目前治療方案：MRS輕度感染 ：利福平、SMZ-TMP、環(huán)丙沙星；嚴重感染：萬古霉素。對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌稱之為VRSA（Vancomycin-risistant S.aureus） 只能用鏈陽霉素治療。目前金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥尚不多見，國外學者將腸球菌耐萬古霉素基因轉移到金黃色葡萄球菌中已獲得成功；日本、香港散在報道且僅萬古霉素低度耐藥（MIC8μ g/ml），且國際上尚未承認；2002

41、年6月美國從一40歲患有糖尿病、慢性腎臟衰竭患者導管中分離到對苯唑青霉素MIC >16μ g/ml,對萬古霉素MIC>128μ g/ml的耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌，VRSA就在我們眼前。,2.腸球菌的檢測：腸球菌是一種重要的病原微生物，實驗室應做高耐慶大霉素腸球菌的檢測。若高耐慶大霉素，則不能和作用細胞壁的藥物（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素）協(xié)同使用。 有條件的實驗室還應作Van A,Van B,Van C耐藥基因監(jiān)測

42、。治療原則：Van A：青霉素敏感（S），氨基糖苷類非高耐--青霉素+慶大霉素；青霉素耐藥（R），氨基糖苷類非高耐--青霉素/頭孢類+壁霉素+慶大霉素。Van B：氨基糖苷類非高耐株--壁霉素+慶大霉素。氨基糖苷類高耐株--壁霉素，新生霉素+氟喹諾酮類。多重耐藥的腸球菌目前尚無有效的治療方案。,（2）．腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥和萬古霉素耐藥篩選試驗（瓊脂稀釋法）篩選試驗 慶大霉素HLAR抗生素含量： 500μg/ml

43、接種： 液體生長法或直接菌落法至 0.5麥氏比濁管。瓊脂-10ul0.5麥氏比濁管懸液點種在瓊脂表面。 孵育條件 35℃空氣孵育時間 24小時結果：瓊脂：>1菌落=耐藥；肉湯：任何生長=耐藥,耐藥-不能和作用細胞壁的藥物協(xié)同（如氨芐西林、青霉素、萬古霉素），敏感-可以和敏感的作用于細胞壁的藥物協(xié)同（如氨芐西林、 青霉素、萬古霉素）。質控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌AT

44、CC51299-耐藥,篩選試驗： 萬古霉素耐藥抗生素含量： 6 μg/ml接種：肉湯-推薦標準肉湯稀釋法。 液體生長法或直接菌落法至 0.5麥氏比濁管。1-10 μl0.5麥氏 比濁管懸液點種在瓊脂表面。 孵育條件 ：35℃空氣孵育時間 ：24小時結果： >1菌落=耐藥 進行萬古霉 素MIC測定 和動力試驗產生的色素來區(qū)別獲得性耐藥 （Va

45、nA,VanB） 和那些對萬古霉素天然的中 水平耐藥（VanC） 如敦雞腸球菌、鉛 腸球菌和黃腸球菌， 它們通常在萬古霉素 篩選平板上生長。質控菌株：糞腸球菌ATCC29212-敏感；糞腸球菌ATCC51299-耐藥,3.超廣譜β –內酰胺酶檢測： 超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯氏菌等革蘭氏陰性桿菌在抗生素選擇壓力下產生。它是質粒介導的對第一、二、三頭孢菌素、氧亞氨基β-內酰胺抗生素耐藥

46、，有時盡管體外試驗是敏感的，是β-內酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突變而來。 ESBLs編碼基因在質粒上，易在不同菌株間播散，表現(xiàn)為多重耐藥。目前將ESBLs分為TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特點是能被β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。,(1)．紙片初篩：培養(yǎng)基： Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度: 頭孢潑肟 10 μg 或頭孢他啶30 μg 或頭孢噻肟 3

47、0 μg 或頭孢曲松 30 μg （使用兩個以上紙片做篩選試驗可提高檢出靈敏度）接種：按標準紙片擴散法孵育條件： 35℃大氣環(huán)境孵育時間： 16-18小時結果： 頭孢泊肟抑菌環(huán) ≤22mm， 頭孢他啶抑菌環(huán)≤22mm，氨曲南抑菌環(huán) ≤27mm，頭孢噻肟抑菌環(huán)≤27mm，頭孢曲松抑菌環(huán)≤ 25mm，=可能產生ESBL。建議質控方法: 大腸埃希菌ATCC25922（參考NCCLS抑菌標準）

48、 肺炎克雷伯菌 ATCC700603:頭孢潑肟抑菌環(huán) 9-16mm,頭孢他啶抑菌環(huán) 10-18mm,氨曲南抑菌環(huán) 9-17mm,頭孢噻肟抑菌環(huán) 17-25mm,頭孢 曲松抑菌環(huán) 16-24mm。,(2)紙片確證試驗：培養(yǎng)基： Muller-Hinton瓊脂藥敏紙片濃度： 頭孢噻肟 30 μg 、 頭孢噻肟/棒酸 30 μg/10 μg和頭孢他啶/棒酸 30 μg/10 μg接種： 按標準紙片

49、擴散法孵育條件 ： 35℃大氣環(huán)境孵育時間 ： 16-18小時 結果：混合棒酸藥物紙片的抑菌圈直徑比無棒酸藥物紙片的直徑大5 mm 以上=ESBL建議質控方法：大腸埃希菌ATCC25922單獨藥物和混合棒酸藥物兩種紙片的抑菌環(huán)直徑相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌 ATCC700603：頭孢他啶單獨藥物和混合棒酸藥物紙片抑菌環(huán)較頭孢他啶單獨藥物紙片抑菌環(huán)直徑增大5 mm以上，頭孢噻肟單獨藥物和混合棒酸藥物紙片抑菌環(huán)較頭孢噻肟單獨藥

50、物紙片抑菌環(huán)直徑 增大3 mm以上。,(3)液體稀釋法初篩:培養(yǎng)基： CAMHB（調節(jié)好陽離子的M-H肉湯）抗生素濃度：頭孢潑肟 4μg/ml 或 頭孢他啶1 μg/ml 或氨曲南 1 μg/ml 或頭孢噻肟 1 μg/ml 或頭孢曲松1 μg/ml （使用1種以上藥物做篩選試驗可提高檢出靈敏度）接種： 按標準肉湯稀釋法的規(guī)定進行孵育條件：35℃；空氣孵育時間：16-18小時結果判讀：生長=可疑有ESBLS的產生（即頭孢他

51、啶、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢曲松 MIC≥2 μg/ml；頭孢潑肟MIC≥8 μg/ml ）質控建議：大腸埃希氏菌ATCC25922不長肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，頭孢潑肟MIC≥8 μg/ml,(4)液體稀釋法確證: 培養(yǎng)基:CAMHB藥物濃度:頭孢他啶0.25-128μg/ml, 頭孢他啶/克拉維酸0.25/4-128/4μg/ml和頭孢噻肟0.25-64μg/ml,頭孢噻肟/克拉維酸0.25/4-64/4μg/m

52、l。確證試驗需要同時使用頭孢他啶、頭孢噻肟，單獨和聯(lián)合克拉維酸復合制劑。接種:按標準肉湯稀釋法的規(guī)定進行孵育條件:35℃空氣孵育時間:16-20小時結果判讀:對2個中任何一個藥物的MIC，在加入克拉維酸后，MIC與不加克拉維酸的MIC值降低3個以上對倍稀釋度，判定為ESBLs（如頭孢他啶的MIC=8 μg/ml，頭孢他啶/克拉維酸的MIC為1 μg/ml）。質控建議:肺炎克雷伯菌ATCC700603：聯(lián)合克拉維酸的復合

53、制劑的MIC與單藥的MIC相比，應當降低3個以上對倍稀釋度。,治療原則是：1.碳青霉烯類抗生素，2. β-內酰胺類/酶抑制劑,3.氨基糖苷類抗生素如阿米卡星，4.頭霉烯抗生素如頭孢西丁。在超廣譜β-內酰胺酶 檢測條件不具備的地方，臨床可以通過實驗室報告的作推測治療，若藥敏報告提示三代頭孢例如頭孢潑肟、頭孢他啶、氨曲南、 頭孢噻肟、頭孢曲松有二者以上耐藥極有可能是產超廣譜β-內酰胺酶 。,4、D試驗-克林霉素誘導耐藥試驗 ： 葡萄

54、球菌對大環(huán)內酯類抗生素耐藥表現(xiàn)為：①由msrA基因介導的主動外排機制，即M型耐藥；②抗生素作用靶位的改變，即由erm基因編碼的RNA甲基化酶對細菌核糖體50S亞基23SrRNA進行特定核苷酸殘基甲基化，使藥物與靶位的結合能力下降，導致對具有相同靶位的大環(huán)內酯類、林可酰胺類、鏈陽菌素B三類藥物同時耐藥，臨床稱為MLS型耐藥。體外藥敏試驗又可將MLS型分為結構型（cMLS型）和誘導型（iMLS型）；cMLS型為紅霉素和克林霉素均耐藥；iML

55、S型紅霉素耐藥、克林霉素敏感。,對大環(huán)內酯耐藥的葡萄球菌可能對克林霉素的耐藥,通過erm 基因編碼的23S rRNA 甲基化也稱為MLSB（大環(huán)內酯、林可和B 型鏈陽霉素）耐藥，或只對大環(huán)內酯類耐藥（由msrA 基因編碼的外排機制）。,M-H平板或血平板，紙片相鄰試驗，對于葡萄球菌，距紅霉素紙片（15μg/片）邊緣15～26mm 處放置克林霉素紙片(2μg/片)來進行檢測；對于β-溶血鏈球菌，將克林霉素紙片(2μg/片)和紅霉素紙片（1