用半套式pcr檢測蜱和嚙齒動物中查菲埃立克體

1、<p>　　用半套式PCR檢測蜱和嚙齒動物中查菲埃立克體</p><p>　　關(guān)鍵字： 嚙齒動物 </p><p>　　查菲埃立克體是1987年報道的人單核細(xì)胞埃立克體病的病原體［1］，于1991年在美國被分離鑒定和定名［2］。該病臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、頭痛、肌痛，實(shí)驗(yàn)室檢查有白細(xì)胞減少、血小板減少和轉(zhuǎn)氨酶升高。現(xiàn)已證明美洲花蜱（Amblyomma americanum）和變異

2、革蜱（Dermacentor variabilis）可以作為查菲埃立克體的傳播媒介，白尾鹿（Odocoileus virginianus）可能是其動物宿主［3］。目前報道的病例主要分布于美國南部，在歐洲、非洲亦有病人出現(xiàn)，我國尚無該病例的報道，但南方很多地區(qū)的自然環(huán)境、氣候條件及蜱種均與美國該病流行區(qū)極為相似，在云南和福建的蜱中檢測到查菲埃立克體DNA特異片段［4］。為了解這些地區(qū)是否有查菲埃立克體自然疫源地的存在，及蜱類和野生動物的感

3、染情況，我們應(yīng)用半套式PCR技術(shù)，檢測蜱及野生動物中查菲埃立克體DNA，對特異片段克隆后，進(jìn)行序列分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下： </p><p><b>　　1　材料和方法 </b></p><p>　　1.1　現(xiàn)場情況　調(diào)查點(diǎn)位于閩西北武夷山南麓山地，海拔300～700m，年平均溫度為17.6℃，相對濕度80％左右，年降雨量1600mm，植被以針、闊混交林為主，山多林深

4、，氣候濕潤，是動物繁殖和昆蟲孳生的適宜場所，存在多種自然疫源性疾病。 </p><p>　　1.2　標(biāo)本的收集　蜱標(biāo)本系1997～1998年間從林區(qū)草叢采集的游離蜱及從家畜和野生動物宿主（山麂、山羊、野豬、野兔、狗、牛、狐貍等）體表捉到的寄生蜱，共計755只，經(jīng)鑒定，按種類和宿主分組檢測。野鼠和野兔系同期在該地捕獲，現(xiàn)場解剖，取脾和血塊冷藏保存，脾臟39份，血塊35份。野生動物種類及數(shù)量見表1。 </p&g

5、t;<p>　　1.3　PCR引物　參照文獻(xiàn)［5、6］　構(gòu)建查菲埃立克體16S rRNA基因特異引物，外引物HE1和PER2可擴(kuò)增587bp的片段，HE1和HE3進(jìn)行半套式PCR可擴(kuò)增390bp的片段，引物的序列如下（根據(jù)M73222）： </p><p>　　HE1（49-77）5?-CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT-3? </p><p>　　H

6、E3（438-412）5?-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3? </p><p>　　PER2（635-613）5?-CTCTACACTAGGAATTCCGCTAT-3? </p><p>　　引物由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所合成。 </p><p>　　1.4　PCR模板的制備 </p><p>　　1.4.1　

7、蜱標(biāo)本　將蜱用75％的酒精浸泡30min后，用無菌生理鹽水洗3次，吸血蜱1只1組，未吸血蜱2只或5只1組，用研磨器研碎，加入含蛋白酶K 100μg／ml的TE 300μl，55℃水浴1h，用酚：氯仿法抽提，兩倍體積無水乙醇沉淀，70％酒精洗滌，干燥后，加50μlTE溶解，－20℃貯存?zhèn)溆谩?</p><p>　　1.4.2　野鼠臟器及血塊標(biāo)本　以無菌操作取野鼠脾臟3mm見方小塊，用研磨器研碎（凍融的血取100μl

8、），加蛋白酶K消化液（0.1m M Tris-Cl pH8.0，0.5μm EDTA pH8.0，0.5％ SDS，100μg／ml蛋白酶K）300μl，55℃水浴3h，中間多次振蕩，至清亮無可見組織塊，抽提及以后步驟同蜱標(biāo)本處理。 </p><p>　　1.5　PCR擴(kuò)增　第一輪擴(kuò)增，取上述DNA模板3μl，10×PCR緩沖液3μl，引物（HE1和PER2）濃度為0.1μmol／L，dNTPs 50μ

9、mol／L，總反應(yīng)體積為30μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性180s，94℃ 60s，56℃ 75s，72℃ 70s擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物1μl為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，方法條件均同第一輪（引物為HE1和HE3）。兩輪產(chǎn)物各取10μl，用含溴化乙錠的1.4％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。 </p><p>　　1.6　PCR產(chǎn)物的克隆與序列測定　用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法回收第二輪PCR

10、擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)純化，連接到pGEM-T載體（美國Promega公司產(chǎn)品）上；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主E.coli XL1-blue（美國Ivitogens公司產(chǎn)品），轉(zhuǎn)化子在含X-gal和IPTG（美國Promega公司產(chǎn)品）的平板上以藍(lán)、白斑法篩選。挑取白色菌落，以HE1和HE3為引物做PCR快速鑒定，取陽性克隆，液體培養(yǎng)增菌；用QIApreg試劑盒（德國QIAGEN公司產(chǎn)品）提取雙鏈重組質(zhì)粒DNA，應(yīng)用373A自動測序儀測序。 <

11、;/p><p>　　1.7　DNA同源性比較　通過Internet網(wǎng)進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）站點(diǎn)后，利用BLAST工具，與GenBank中注冊的核苷酸序列進(jìn)行比較。 </p><p><b>　　2　結(jié)果 </b></p><p>　　2.1　蜱標(biāo)本檢測結(jié)果　對不同來源的蜱標(biāo)本先分批進(jìn)行檢測然后統(tǒng)一進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)檢測的結(jié)果與分批檢測

12、的結(jié)果一致性良好。對個別結(jié)果有差異的標(biāo)本，再進(jìn)行第三次試驗(yàn)，以最后一次結(jié)果為準(zhǔn)。從福建山麂、山羊、野兔、水牛體表采集的越原血蜱成蜱及從草地采集的游離越原血蜱成蜱標(biāo)本中擴(kuò)增出目的DNA片段（圖1）。共檢測越原血蜱成蜱616只（240組），31組陽性，按每組至少有1只蜱陽性計算，則最小陽性率為5.0％。檢測卵形硬蜱成蜱68只，中華硬蜱成蜱23只，豪豬血蜱成蜱14只，粒形硬蜱成蜱4只，均未檢出查菲埃立克體DNA。檢測越原血蜱若蜱30只，結(jié)果均

13、為陰性。 </p><p>　　2.2　動物臟器及血塊標(biāo)本檢測結(jié)果　共檢測野鼠脾臟標(biāo)本39份，有22份陽性，陽性率為56.4％。檢測上述野鼠的血塊標(biāo)本共31份，13份（38.7％）陽性。脾臟和血塊均陽性的鼠有8只。6種鼠中，社鼠的檢出陽性率最高。另外，檢測野兔血塊標(biāo)本4份，2份為陽性（表1）。代表性標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。 </p><p>　　2.3　測序分析及結(jié)果　選擇越原血蜱陽性標(biāo)本2

14、份，野鼠脾臟和血塊陽性標(biāo)本各1份，經(jīng)半套式PCR擴(kuò)增后，對390bp的DNA片段進(jìn)行克隆和序列測定。4份標(biāo)本測序結(jié)果完全一致。將測定的DNA序列輸入BLAST分析程序，在GenBank中搜索，進(jìn)行最大同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與查菲埃立克體美國分離株16SrRNA基因?qū)?yīng)片段完全一致。 </p><p><b>　　3　討　論 </b></p><p>　　PCR用于查菲埃

15、立克體研究領(lǐng)域國內(nèi)外均有報道，但是將此種半套式PCR技術(shù)應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，檢測現(xiàn)場野生動物內(nèi)臟及血塊中的查菲埃立克體國內(nèi)尚未見報道。從16Sr RNA基因序列高變區(qū)構(gòu)建的針對查菲埃立克體的特異引物HE1和PER2及HE3，具有很高的特異性，僅能擴(kuò)增查菲埃立克體DNA，而對其它埃立克體種16S rRNA基因都不能擴(kuò)增［5］。用此半套式PCR技術(shù)檢測現(xiàn)場采集的越原血蜱、野鼠脾臟和血塊及野兔血塊，結(jié)果均獲得了查菲埃立克體特異的DNA片段，而

16、從人粒細(xì)胞埃立克體及斑點(diǎn)熱立克次體DNA中擴(kuò)增不出特異片段。同時，用有限稀釋法，對這兩對引物的半套式PCR敏感度進(jìn)行評價，結(jié)果顯示：最低能檢測到4個拷貝的查菲埃立克體DNA。由于查菲埃立克體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，分離培養(yǎng)甚為困難。極大地限制了對它的研究。因此，對于這種一般實(shí)驗(yàn)室難以檢測而且分離成功率極低的病原體，半套式PCR及序列測定技術(shù)具有快速、簡便、靈敏、特異，對原始材料要求不高的特點(diǎn)，為直接在蜱和野生動物中檢測和鑒定查菲埃立克體提供

17、了有力的手段。 </p><p>　　本次及以前的研究［4］中，從野外采集的越原血蜱中檢測到查菲埃立克體DNA，是該種蜱自然感染的有力證據(jù)。越原血蜱是當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢蜱種，在我們采集到的蜱中占83.7％，作為傳播媒介的可能性很大。5.0％的最小陽性率與以前報道的4.3％的差別可能與樣本量及蜱中存在的抑制查菲埃立克體16S rRNA基因擴(kuò)增的物質(zhì)有關(guān)。因此，今后基于PCR的蜱查菲埃立克體DNA調(diào)查應(yīng)多檢測單只蜱，以更準(zhǔn)確

18、地估計感染率。 </p><p>　　本次調(diào)查野鼠脾臟及動物血塊中查菲埃立克體DNA陽性率分別為56.4％和38.7％，J.Mitchell Lockhart等檢測美國佐治亞州22只白尾鹿脾臟及外周血的查菲埃立克體DNA陽性率分別為41％和18％［7］，因?yàn)榈赜虿煌?，宿主動物不同，?biāo)本量不同，差別大是可能的，但在脾臟中比血塊中檢出率高這一點(diǎn)上兩者是一致的。這表明調(diào)查點(diǎn)鼠類及野兔可能感染查菲埃立克體，它們作為貯存宿

19、主的可能性值得重視。同時，因?yàn)樵皆绯＜纳谂?、山羊等大型動物上，所以它們作為貯存宿主的可能性也不排除。因本次調(diào)查采集到的動物種類及數(shù)量均較少，缺少對人群的調(diào)查，所以更細(xì)致全面的流行病學(xué)調(diào)查還要繼續(xù)進(jìn)行。 </p><p>　　總之，本研究結(jié)果說明，福建省可能存在查菲埃立克體的自然疫源地，越原血蜱和野鼠、野兔可能分別為其傳播媒介和貯存宿主，但應(yīng)進(jìn)一步從蜱類和野生動物及病人分離病原體，才能證實(shí)。然而，在該地區(qū)及具