犬埃立克體(Ehrlichia canis)分離鑒定、基因組學(xué)及動物感染模型的建立.pdf

1、埃立克體是Anaplasmataceae科中的一類嚴(yán)格胞內(nèi)寄生、以蜱蟲為主要傳播媒介的革蘭氏陰性微生物，其具有廣泛的感染宿主譜。根據(jù)16S rRNA基因和其他相關(guān)基因的序列，目前Ehrlichia屬包括5個種:Ehrlichia canis、E.chaffeensis、E.ruminantium、E.ewingii、E.muris。其中E chaffeensis主要在人群中流行，并引起人單核細(xì)胞埃立克體病(human monocytic

2、 ehrlichiosis，HME);E.rummantium主要感染反芻動物，如牛、綿羊、山羊等，給相關(guān)的養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失;而E.canis是一種主要感染犬科動物導(dǎo)致犬單核細(xì)胞埃立克體?。╟anine monocytic ehrlichiosis，CME）的人獸共患傳染性病原體。E.canis感染犬之后主要表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、厭食、眼鼻分泌物增多等臨床癥狀，并可分為急性感染期、亞臨床癥狀期、慢性感染期三個階段。
　　

3、作為一種重要的人獸共患傳染性病原體，E.canis主要感染犬科動物尤其是伴侶動物給人類健康帶來了巨大的威脅。本研究通過建立一種可以同時檢測所有埃立克體的FRET-qPCR方法并將其應(yīng)用于中國的伴侶動物和反芻動物樣品中，從而調(diào)查中國埃立克體病的流行現(xiàn)狀;并通過犬巨噬細(xì)胞系，在體外培養(yǎng)獲得E.canis YZ1菌株;同時，對其與細(xì)胞自噬的關(guān)系做了初步探索;進一步對其全基因組序列進行測定和分析;通過實驗比格犬模型，對此分離株的致病性、治療等進

4、行了系統(tǒng)地研究。
　　一、檢測所有埃立克體種的FRET-qPCR方法的建立
　　目前，埃立克體屬得到認(rèn)可的種主要有5個，但同時隨著檢測技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展越來越多的對養(yǎng)殖業(yè)、人和動物健康具有巨大威脅的菌株被發(fā)現(xiàn)，如Panola Montain Ehrlichia(PME)等。但現(xiàn)在的血清學(xué)檢測方法在埃立克體屬內(nèi)部甚至Anaplasmataceae科內(nèi)部存在交叉反應(yīng)，而目前已有的PCR檢測方法只能檢測單個或部分埃立克

5、體種或者無法區(qū)分與埃立克體同源性相近的其他蟲媒病原體。本研究根據(jù)16SrRNA基因中保守區(qū)間設(shè)計了一對引物和一對探針，建立了一種可以在單個反應(yīng)孔中同時檢測并分型所有常見埃立克體種的FRET-qPCR方法，并可以通過高分辨率熔解曲線分析中Tm值的不同將所有埃立克體分為4個組:E.rummantium(Tm～55.8℃)，E.chaffeensis和E ewingii(Tm～57.7℃),E.canis、E.muris、E.ovina和Eh

6、rlichia sp.BOV2010(Tm～62.0℃)，the Panola Mountain Ehrlichia(Tm～65.5℃);且此檢測方法具有極高的靈敏度，可以在每個反應(yīng)孔中最低檢測到單個拷貝的病原體核酸。本研究更進一步通過將此靈敏特異的FRET-qPCR應(yīng)用于5個加勒比海島的反芻動物樣品中埃立克體病流行現(xiàn)狀的調(diào)查之中進一步驗證了此方法的可行性，且結(jié)果表明其中有12.2％(134/1,101)的動物感染了埃立克體病原體，其中

7、包括牛76份(19.7％，76/385)，綿羊45份(13.2％，45/340)、山羊13份(3.5％，13/376);進一步通過巢式PCR和基因測序發(fā)現(xiàn)所有感染的埃立克體為E.canis或者與其同源性及其相近的埃立克體菌株。
　　二、中國伴侶動物和反芻動物埃立克體病的分子流行學(xué)調(diào)查
　　中國具有悠久的寵物飼養(yǎng)和野生動物馴化為家畜飼養(yǎng)的歷史，近年來隨著中國經(jīng)濟的飛速發(fā)展，畜牧養(yǎng)殖業(yè)得到了長足發(fā)展，家畜存欄量位居世界前列;同時

8、隨著居民生活水平的不斷提高，寵物數(shù)量也在逐年增加。與此同時，家畜和伴侶動物中傳染病尤其是人畜共患傳染病數(shù)量也在不斷增加，給人類食品安全和生命健康帶來了巨大威脅，尤其是其中的蟲媒疾病等慢性傳染病，大大降低了家畜的經(jīng)濟價值。為了進一步了解埃立克體病在中國伴侶動物和反芻動物中的流行現(xiàn)狀，通過分子生物學(xué)方法對來自中國10個省份12城市的1，114份犬血液樣品及其體表寄生蟲（146份蜱蟲、37份虱子）和12省份的2，240份反芻動物樣品中埃立克體

9、病的流行現(xiàn)狀進行了調(diào)查。結(jié)果顯示，有15份犬血液樣品(1.3％，15/1，114)、6份蜱蟲樣品(4.1％，6/146)中具有埃立克體的核酸，且通過進一步確定其為E.canis;同時，2份綿羊樣品(0.8％，2/111)、3份山羊樣品(1.1％，3/270)、65份牛樣品(3.6％，65/1，830)、0份水牛樣品(0/29)表現(xiàn)為埃立克體核酸陽性，進一步通過gltA基因確定，感染的埃立克體為E.canis或與其及其相近的埃立克體菌株。

10、
　　三、Ehrlichia canis的體外分離培養(yǎng)
　　Ehrlichia canis是一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性微生物，其脫離宿主細(xì)胞后2-3小時即會死亡。該病原體首次于1935年的阿爾及利亞被發(fā)現(xiàn)，中國于1999年在軍用犬中首次報道。E.canis最初通過培養(yǎng)陽性感染犬的單核細(xì)胞來保存病原體，隨后通過陽性感染的單核細(xì)胞接種于未感染的細(xì)胞獲得持續(xù)培養(yǎng)，并最后通過DH82犬巨噬細(xì)胞系獲得持續(xù)傳代培養(yǎng)，隨后又在人-犬雜交

11、細(xì)胞系、人微血管細(xì)胞、BALB/C小鼠巨噬細(xì)胞，以及蜱蟲細(xì)胞系IDE8、ISE6、IRE/CTVM18中獲得了體外培養(yǎng)。中國也通過保存陽性感染犬的淋巴細(xì)胞保存了E.canis病原體，但目前為止還沒有體外傳代培養(yǎng)的報道。本研究通過DH82犬巨噬細(xì)胞從陽性感染犬的淋巴細(xì)胞中成功在體外培養(yǎng)了E.canis病原體，并獲得了持續(xù)傳代培養(yǎng);同時，成功在Vero非洲綠猴腎細(xì)胞中獲得持續(xù)培養(yǎng)。通過吉姆薩染色，本研究觀察研究了E.canis在感染DH82

12、細(xì)胞和Vero細(xì)胞后的第1、2、3天不同時期時細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)特征，并成功觀察到其在感染細(xì)胞內(nèi)形成的內(nèi)涵體(morula)形態(tài)特征。
　　四、Ehrlichia canis YZ1菌株全基因組測序及比較基因組學(xué)分析
　　本研究通過第三代測序技術(shù)，對中國首次分離獲得的E.canis YZ1株病原體進行了全基因組測序及分析，并在世界范圍內(nèi)獲得了第二個E.canis的全基因組序列。獲得E.canis YZ1菌株的基因組總長度為1，31

13、4，789bp，其中編碼基因長度為956，238bp，共編碼1，022個基因，基因組中％GC為29.0％;其中有65個散在重復(fù)序列和158個串聯(lián)重復(fù)序列;同時預(yù)測到一個長度為44，886bp的基因島。通過與rRNA庫比對后共找到36個tRNA可以轉(zhuǎn)運20種氨基酸，1個5S rRNA，1個16S rRNA和1個23S rRNA。通過對所有基因進行功能分析，共獲得GO功能注釋結(jié)果2，959個，其主要集中在細(xì)胞過程和新陳代謝過程;其中537個

14、基因與KEGG代謝通路有關(guān)，而且74個與翻譯生物過程有關(guān);其中757個基因的氨基酸序列與COG生物功能有關(guān)，且135個與翻譯、核糖體組成和生物合成有關(guān)。通過與其他6株埃立克體菌株（E.canis strain Jake，E.ruminantium，E.muris，E.chaffeensis，E.mineirensis，Ehrlichia sp.）進行共線性分析，其中只有E.canis Jake菌株參考基因組中99.3％的部分與E.can

15、is YZ1菌株基因組中的99.3％的序列參與了線性化比對，而其他5個參考序列參與比對時E.canis YZ1菌株參與部分低于80％、參考序列低于90％，共線性較差。將E.canis YZ1菌株與參考序列進行全局比對，與E.canis參考序列相比具有最少的（1，748個）在基因水平上由單個核苷酸變異引起的潛在的DNA序列多態(tài)性SNP位點;E.canis YZ1菌株基因組CDS內(nèi)部存在多個插入和缺失突變類型。同時，E.canis YZ1菌

16、株的起始段和末尾段與E.canis strain Jake參考基因組序列相比存在倒置和易位突變。
　　五、細(xì)胞自噬在Ehrlichia canis感染中作用機制的初步研究
　　Ehrlichia canis是一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生、主要感染犬科動物的蜱傳病原體，主要引起犬單核細(xì)胞埃立克體病。雖然E.canis的宿主譜很廣，其中也有感染人的報道，但是截至目前還沒有自噬在E.canis感染宿主細(xì)胞時作用方式的相關(guān)研究。本研究通過聚丙烯

17、酰胺凝膠電泳、蛋白印記、免疫熒光等多種方法對E.canis感染DH82細(xì)胞和Vero細(xì)胞時自噬相關(guān)蛋白的變化情況進行了研究。結(jié)果顯示，E.cams感染的犬巨噬細(xì)胞和猴腎細(xì)胞中LC3蛋白表達量上升、p62蛋白表達量少量下降;GFP-LC3標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞后出現(xiàn)了點狀聚集且集中于病原體周圍，且LC3雙熒光慢病毒感染細(xì)胞后出現(xiàn)了紅色和綠色熒光的疊加，且綠色熒光未發(fā)生明顯的降解;同時，RAB5也在包被病原體的膜結(jié)構(gòu)表面形成點狀聚集;通過自

18、噬抑制劑bafilomycin、3-MA和自噬促進劑rapamycin處理E.canis感染的細(xì)胞并分別作用于溶酶體、PI3K和mTOR后，病原體的增殖速率均得到了提升。由此說明，自噬相關(guān)蛋白LC3、p62、RAB5、PI3K等均參與了E.canis感染宿主細(xì)胞的過程;同時，病原體E.canis可以利用宿主細(xì)胞自噬過程獲得營養(yǎng)物質(zhì)進行擴增繁殖;而且，E.canis感染后形成內(nèi)涵體后不會與溶酶體結(jié)合，從而可以逃避宿主細(xì)胞的對外來物質(zhì)的清除