水稻類金屬硫蛋白（rgMT）基因功能解析及對苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、東北林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文水稻類金屬硫蛋白（rgMT）基因功能解析及對苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化研究姓名：金淑梅申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：園林植物與觀賞園藝指導(dǎo)教師：柳參奎20060601A b s t r a c tS a l i n a t i o n s o i l a r et h ek e yf a c t o r o fe n v i r o n m e n t a l c r i s i s ．S o t h e r e s e a r

2、c h o nt h eg e n ee n g i n e e r i n gw i l l p l a y e x t r e m ei m p o r t a n tf u n c t i o nf o rt h e a l t e r a t i o n t o t h es a l i n a t i o n s o i l ．W eh a v eg o t t h er g M T g e n ef r o mt h er

3、i c ee D N A l i b r a r y ，R e s e a r c hg e n ei n d u c e d e x p r e s s i o nu n d e rs e v e r a l a b i o t i c s t r e s s e s a n d r e s e a r c h i t s f u n c t i o n i n E c o l i a n d Y e a s t ．R e g e n

4、 e r a t i o n m a dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m o fM e d i c a g os a t i v a ( a l f a l f a ) w a s e s t a b l i s h m e n t ．W e i n t r o d u c e d r g M Tg e n ei n t oM e d i c a g os a t i v ab yg e n

5、ee n g i n e e r i n g ．I tC a n e n l a r g et h eg r o w t hr a n g eo f M e d i c a g os a t i v aw h i c hp l a yi m p o r t a n tr o l e o ni m p r o v e m e n te n v i r o n m e n t ，p r e v e n t i o nt h el o s s

6、 w a t e ra n ds o i la n d e n c h e n c e m e n t t h en u t r i t i o n o f s o i l ．W ep r e v i o u s l yi s o l a t e dag e n ef r o ma r i c er o o tc D N A l i b r a r yw h o s ee x p r e s s i o ni m p r v e d t

7、 h ec a r b o n a t et o l e r a n c ei nE ．c o l i ；T h eg e n e o p e n r e a df r a m e i s 2 2 2 b p ．T h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f t h eg e n ei st h es a m e a s t h a to f a nM T - l i k ep

8、r o t e i nf r o mr i c e ( G e n B a n ka c c e s s i o nn o ．$ 5 7 7 6 8 ) ．T h e r g M T g e n ee x p r e s s i o n w a si n d u c e d u n d e r s e v e r a la b i o t i cs t r e s s e sf r o ms a l t sr N a C la n dN

9、 a H C 0 3 ) ，d r o u g h t ( 1 0 ％P E G6 0 0 0 ) a n dh e a v y m e t a li r o n ( C d C l 2 ，C u C l 2a n dZ n C l 2 ) i nr i c el e a v e sa n d r o o t s ．T h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h er g M T g e n

10、ew a si nr e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ．T h er g M T g e n eC a ne x p r e s sa n d o b t a i np u r i f i e dp r o t e i ni nE c o l i ．T h ef i n a ly i e l do ft h ep u r i f i e dr g M T

11、p r o t e i nw a s a b o u t 4 ．8 m g g ’’d r yc e l l s ．C o n c e n t r a t i o n s o f v a r i o u sm e t a li o n st h a t w e r es u i t a b l ef o r c o m p a r i n g m e t a l —i o nt o l e r a n c eo f t r a n s

12、f o r m e da n dn o n —t r a n s f o r m e dEc o l iw e r e1 ．6m M C d C l 2 ，4 ．7m M C u C l 2 a n d1 ．7m M Z n C l 2 ．T h em e t a l —i o n ( C d ”，C u 2 + , a n dZ n ”) t o l e r a n c eo f E ．c o l ic e l l se x p r

13、e s s i n gr g M T f u s i o np r o t e i n i n c r e a s e d ．T h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tr g M T f u n c t i o n si nE c o l ic e l l s ．T h e t o l e r a n c eo f y e a s t se x p r e s s i o nr g M T w

14、a s a n a l y z e d t ok n o w r e l a t i o nb e t w e e n r g M T a n ds t r e s s ．A sy e a s ti se u k a r y o t e o r g a n i s m ，i th a s t h es i m i l a r m e t a b o l i z i n g r o u t e ，r g M Tw a sc o n s t

15、 r u c t e dy e a s t e x p r e s sv e c t o r ，a n d i n d u c e d f o re x p r e s s i n g p r o t e i n ，A n a l y s i s o f t h et o l e r a n c e ，t r a n s f o m m n ty e a s t e x p r e s s i o nr g M T p r o t e

16、i n i n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h t h e c o n t r 0 1 ．T h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e i n c r e a s e dt o l e r a n c e o f y e a s t h i g h l y e x p r e s s i o n gr g M T a l s oe n h a n c

17、 e dp l a n t e x p r e s s i n gr g M T ．T h e e x p l a n t w a s c o t y l e n d e r o f a l f a l f a ( m e d i c a g os a t i v a ) ，a n dM S w a s r e g a r d e d a st h eb a s i cm e d i u m ，t h ed i f f e r e n

18、tc o m b i n a t i o n o f 2 ，4 一Da n d 6 - B A w e r ea d d e d i n t ot h em e d i u m t oi n d u c et h e c a l l u s ．T h er a t eo f i n d u c e m e n t r a n g e df r o m5 5 ％t o9 0 ．6 ％，a m o n go f t h e m2 m g ／

19、L 2 ，4 - D + 1m g ／L6 - B A m e d i u m i st h eb e s t ( 9 0 ．6 ％) ．T h eh i g h e s td i f f e r e n t i a t i o n m e d i u m w a s M S + 2 m g ／LK T + O ．3 m g ／L 6 - B A + 0 ．1 5 m g ／L N A A u s i n g c a l l u s w