重金屬脅迫下甘蔗生理響應(yīng)與金屬硫蛋白基因的功能鑒定.pdf

1、我國部分耕地受重金屬污染，利用重金屬超富集植物修復(fù)污染耕地具有經(jīng)濟(jì)和環(huán)境友好的特點。金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）是一類富含半胱氨酸的低分子量蛋白，具有結(jié)合重金屬的能力，在調(diào)控重金屬積累與富集中起重要作用，因此，與植物耐受和富集鎘等重金屬的能力密切相關(guān)。根據(jù)前人研究，甘蔗具有耐受和富集銅、鎘等重金屬的能力，考慮到甘蔗還具有高生物量、可多年宿根等特點，因此，基于重金屬超富集植物的視角，研究重金屬脅迫下甘蔗的生理響應(yīng)，克

2、隆甘蔗金屬硫蛋白家族基因并分析它們在重金屬應(yīng)答中的功能，有助于深入研究MT家族基因的功能，并為評價甘蔗是否具有作為重金屬修復(fù)物種利用潛力奠定基礎(chǔ)，選題具有重要的現(xiàn)實意義和理論意義。本研究以甘蔗熱帶種Badila為材料，通過重金屬離子Cu2+、Zn2+或Cd2+脅迫下甘蔗表型、地上部和地下部富集重金屬離子的水平以及相關(guān)生理生化物質(zhì)的測定，并進(jìn)一步在克隆獲得4個分屬于不同亞家族成員的甘蔗金屬硫蛋白家族基因的基礎(chǔ)上，研究甘蔗MTs基因的響應(yīng)特

3、點及其組織表達(dá)特性，初步探討了重金屬脅迫下的甘蔗生理響應(yīng)以及甘蔗不同類型MTs基因在甘蔗應(yīng)答重金屬脅迫中的功能。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1、甘蔗組培幼苗耐受與富集重金屬Cd、Zn或Cu的生理特性
　　甘蔗組培幼苗能夠耐受一定程度的重金屬Cd（100μM）、Zn（500μM）或Cu（100μM）的脅迫，并在處理期間無明顯的中毒癥狀。在脅迫初期（6 h），地上部丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量升高、過氧

4、化物酶(Peroxidase,POD)活性增加、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性和脯氨酸（Proline，PRO）含量下降，表明地上部氧化脅迫加?。籆d2+和Cu2+脅迫后期（48 h），MDA含量下降、POD活性降低、CAT活性和PRO含量增加，推測甘蔗地上部組織抗氧化機(jī)制開始激活并逐漸適應(yīng)脅迫環(huán)境。在高濃度重金屬Cd（250μM）、Zn（1,000μM）或Cu（250μM）的脅迫下，甘蔗Badila組培苗地上部和地下部能富

5、集到Cd2+、Zn2+、Cu2+的含量分別為7.83 mg/kg和223.33 mg/kg、228.63 mg/kg和1,165.67 mg/kg、16.02 mg/kg和404.70 mg/kg，并出現(xiàn)可逆的毒害癥狀。
　　2、甘蔗金屬硫蛋白家族基因的克隆與序列分析
　　采用同源克隆的方法，獲得了4個MTs基因。其中：
　　獲得1個1型MT基因，命名為ScMT1（GenBank登錄號：KJ504373），ScMT1的

6、cDNA序列結(jié)構(gòu)如下：開放讀碼框長228 bp，編碼75個氨基酸，基因組序列含1個內(nèi)含子（283 bp）、2個外顯子（52 bp和176 bp）。
　　獲得1個2型MT基因，命名為ScMT2-1-4（GenBank登錄號：KJ504375），ScMT2-1-4的cDNA序列結(jié)構(gòu)如下：開放讀碼框長252 bp，編碼83個氨基酸，基因組序列含2個內(nèi)含子（483 bp和853 bp）、3個外顯子（64 bp、87 bp和101 bp）。

7、
　　獲得1個3型MT基因，命名為ScMT3（GenBank登錄號：KJ504374），ScMT3的cDNA序列結(jié)構(gòu)如下：開放讀碼框長198 bp，編碼65個氨基酸，基因組序列含1個內(nèi)含子（259 bp）、2個外顯子（50 bp和148 bp）。
　　獲得1個1型MT基因的亞型，命名為ScMT6（GenBank登錄號：KJ504376），ScMT6的cDNA序列結(jié)構(gòu)如下：開放讀碼框長243 bp，編碼80個氨基酸，基因組基因

8、含2個內(nèi)含子（166 bp和114 bp）、3個外顯子（58 bp、84 bp和101 bp）。
　　生物信息學(xué)預(yù)測顯示，上述4個MTs基因所編碼的蛋白均屬于非分泌型酸性親水蛋白，分布在細(xì)胞質(zhì)中的概率最高，主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)和錨定作用，均無β螺旋結(jié)構(gòu)，符合MT基因特點。
　　3、重金屬脅迫下甘蔗金屬硫蛋白基因的表達(dá)模式
　　利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測了Cd（250μM）、Zn（1,000μM）、Cu（250μM）脅迫

9、0 h、6 h、24 h和48 h時間點的MT基因表達(dá)量。結(jié)果表明，從甘蔗中分離獲得的4個MTs基因?qū)χ亟饘倜{迫響應(yīng)的模式存在差異。
　　甘蔗地上部和地下部中ScMT1基因的表達(dá)水平在Cd2+處理的前期和中期無明顯變化，但后期顯著上調(diào)表達(dá)，甘蔗地下部ScMT1對Cu2+脅迫的應(yīng)答模式也是如此，ScMT1在甘蔗地上部受到Zn2+脅迫的誘導(dǎo)而呈總體顯著上調(diào)表達(dá)。上述說明ScMT1在甘蔗地下部響應(yīng)Cd2+和Cu2+脅迫以及地上部響應(yīng)Cd

10、2+脅迫中表現(xiàn)出正響應(yīng)和一定的延遲效應(yīng)，地上部全程正響應(yīng)Zn2+脅迫并未出現(xiàn)延遲效應(yīng)。
　　甘蔗地上部中ScMT2-1-4正響應(yīng)重金屬脅迫，表達(dá)量顯著提高，說明了ScMT2-1-4主要在地上部發(fā)揮積極作用；在地下部中，ScMT2-1-4的響應(yīng)呈變化態(tài)勢，Cd2+脅迫下呈下調(diào)表達(dá)，Zn2+脅迫下先上調(diào)后下調(diào)，Cu2+脅迫下呈初期和后期無顯著變化但中期大幅度上調(diào)表達(dá)，提示了ScMT2-1-4在甘蔗響應(yīng)重金屬脅迫中起積極作用。
　

11、　Cd2+脅迫下，ScMT3在地上部上調(diào)表達(dá)不明顯，而地下部呈總體下調(diào)表達(dá)，提示了ScMT3甘蔗響應(yīng)Cd2+脅迫過程中不起主要作用。在地上部中，ScMT3在Cu2+或Zn2+脅迫下呈持續(xù)顯著上調(diào)表達(dá)；地下部中ScMT3轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)僅發(fā)生在處理前期，在處理中、后期則迅速下調(diào)且與對照無顯著差異；提示了ScMT3主要在甘蔗地上部響應(yīng)Zn2+或Cu2+脅迫過程中起積極作用。
　　植物MTs亞家族的新成員ScMT6對重金屬脅迫的應(yīng)答稍