多年生黑麥草再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小鼠金屬硫蛋白(MT)基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、多年生黑麥草(perennial ryegrass)是重要的冷季型禾本科牧草和草坪草，廣泛分布于溫帶地區(qū)，其葉片光滑柔軟、色澤美麗并且綠色期長(zhǎng)，分蘗能力強(qiáng)，成坪速度快，是一種優(yōu)良的草坪草。哺乳動(dòng)物的金屬硫蛋白(Metallothionein，簡(jiǎn)稱(chēng)MT)是一類(lèi)低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，在動(dòng)物體內(nèi)主要參與必需金屬離子的代謝和有毒重金屬的解毒等過(guò)程。小鼠MT-I具有α和β兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)和功能上既相互聯(lián)系又各有分工，

2、并且對(duì)重金屬具有不同的親和力，其中α結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合Cd2+、Hg2+等，而β結(jié)構(gòu)域優(yōu)先結(jié)合Cu2+、Zn2+等。
　　 本研究以草坪型多年生黑麥草品種“馬蒂達(dá)”為材料，進(jìn)行了多年生黑麥草的再生體系的研究。并在此基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，開(kāi)展了小鼠金屬硫蛋白基因(MT)及其突變體αα基因的遺傳轉(zhuǎn)化初步研究，以為今后最終獲得利用MT及其突變體結(jié)合并解毒重金屬特性的、對(duì)Cd等重金屬抗性和積累能力大大提高的新型植物，用于環(huán)境重金屬污染的

3、生態(tài)修復(fù)。研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　 1、多年生黑麥草的再生體系建立。以成熟種子為外植體，在附加8mg/L2，4-D和0.025 mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率最高，達(dá)56.42％。愈傷組織經(jīng)過(guò)2～3次繼代后分化，分化培養(yǎng)附加2mg/L6-BA時(shí)分化率最高，達(dá)32.25％，且愈傷組織繼代后的狀態(tài)明顯影響分化率。在大量元素減半的MS培養(yǎng)基中附加0.5mg/LNAA進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根率達(dá)98％。
　　 2、進(jìn)行了多年生

4、黑麥草體胚發(fā)生組織學(xué)研究。采用石蠟切片研究組織培養(yǎng)中多年生黑麥草體細(xì)胞胚發(fā)生和發(fā)育的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，以了解體細(xì)胞再生形成胚胎結(jié)構(gòu)的細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生特征。結(jié)果表明：2，4-D誘導(dǎo)的多年生黑麥草體細(xì)胞胚的發(fā)生發(fā)育經(jīng)歷了類(lèi)似合子胚的各階段；在體細(xì)胞胚迅速發(fā)育過(guò)程中，不同階段的體細(xì)胞胚始終與周?chē)?xì)胞存在明顯界限；體細(xì)胞胚大部分以間接途徑產(chǎn)生，由表層愈傷組織分化而來(lái)；為單細(xì)胞起源，能使遺傳轉(zhuǎn)化的再生植株避免嵌合體的產(chǎn)生，且長(zhǎng)期培養(yǎng)也能保持良好的

5、再生率。
　　 3、PPT和潮霉素篩選壓的確定。分別以除草劑抗性基因(bar基因)相應(yīng)篩選劑PPT(Basta)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt基因)相應(yīng)篩選劑潮霉素(Hyg)對(duì)多年生黑麥草愈傷組織進(jìn)行篩選研究，確定了不同篩選劑對(duì)多年生黑麥草的篩選濃度。結(jié)果表明，1mg/L PPT和30mg/L潮霉素作為黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的篩選濃度比較合適。
　　 4、運(yùn)用GUS瞬時(shí)檢測(cè)對(duì)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行探索。性狀良好的胚性愈傷組織預(yù)培