農(nóng)桿菌介導的多年生黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、草坪草在人類生活中的作用日益突出，對其進行品種培育和改良也成為當今世界的一項重要工作。由于傳統(tǒng)育種手段有很大的局限性，利用基因工程培育和改良草坪草品種是一種便捷和實用的途徑，也是草坪草育種研究的必然趨勢。多年生黑麥草是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的重要冷季型草坪草之一，利用植物基因工程技術(shù)改良其除草劑抗性及抗蟲性，不僅可以減少化學除草劑及化學殺蟲劑的使用，保護環(huán)境，節(jié)約草坪維護費用，而且對于保持草坪的觀賞性也有重要作用。目前，黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要

2、有基因槍法、硅碳纖維法、原生質(zhì)體直接轉(zhuǎn)化法及農(nóng)桿菌介導法。 本實驗對黑麥草的組織培養(yǎng)和植株再生進行了研究，通過農(nóng)桿菌介導的方法進行黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化，已獲得轉(zhuǎn)抗除草劑基因的多年生黑麥草植株和轉(zhuǎn)抗蟲基因的多年生黑麥草植株。主要研究內(nèi)容如下： (1)以多年生黑麥草Dt808011的成熟胚為外植體，在MS培養(yǎng)基中附加5mg/L2,4-D，誘導胚性愈傷組織效果較好，胚性愈傷組織的誘導率可達15.1％。在分化培養(yǎng)基中添加一定濃度的6

3、-BA，有助于愈傷組織的分化，6-BA濃度為1mg/L時愈傷組織的分化率較高，建立了高效的黑麥草成熟胚再生體系。 (2)研究了農(nóng)桿菌浸染黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因素，優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件：以繼代5-10天的胚性愈傷組織為受體，農(nóng)桿菌浸染液濃度ODm<,660>=1.0，添加100mg/L的乙酰丁香酮，在0.5×10<'5>Pa負壓下真空處理5min，浸染時間控制在30min以內(nèi)。gus基因瞬間表達分析表明，此條件下獲得的陽性愈傷組織

4、比例較高，可達54.32％。 (3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得。構(gòu)建表達載體p3301-Ubi8c，p3301-Ubi8e和p3301-Ubi8g。分別將pDM805(含抗除草劑bar基因)和上述3個抗蟲基因(crySC、crySE和crySG)的質(zhì)粒載體，導入根癌農(nóng)桿菌AGL1。通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化黑麥草愈傷組織，得到轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過PCR、GUS組織染色及Basta抗性實驗檢測，117株轉(zhuǎn)基因植株中有61株為含bar基因的陽性植株，轉(zhuǎn)