匍匐翦股穎和多年生黑麥草對鎘、鉛脅迫的響應(yīng)及部分基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、土壤被重金屬離子污染造成對植物生長發(fā)育不良影響，嚴(yán)重時會威脅到農(nóng)、牧業(yè)的生產(chǎn)安全。在污染地區(qū)利用各種方法修復(fù)被污染的土壤，降低重金屬污染物質(zhì)對生物代謝和生長發(fā)育的威脅，已經(jīng)成為環(huán)境科學(xué)、生態(tài)學(xué)研究的重點。 論文研究通過將匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)、多年生黑麥草(Loliumperenne)幼苗在Hoagland培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，并將硝酸鎘、醋酸鉛溶液按一定濃度梯度混入培養(yǎng)液中，對培養(yǎng)的草坪草幼苗進(jìn)行重金屬

2、離子脅迫處理，然后分別采用恒重法測定供試樣品生物量的積累量；采用原子吸收分光光度法測定供試植物根系與地上莖葉樣品中重金屬離子積累量；采用熒光分光光度法測定供試樣品葉片中二氯熒光黃雙乙酸(DCF)的熒光值來間接反映葉片中產(chǎn)生的過氧化氫量的變化，來研究脅迫時活性氧(ROS)物質(zhì)產(chǎn)生與積累情況；分別采用甲基氮藍(lán)四唑(NBT)光密度測定法、高錳酸鉀滴定法和愈創(chuàng)木酚法分別測定供試樣品中超氧化物歧化酶(SODs)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(

3、POD)等細(xì)胞抗氧化酶活性變化；采用RNA和cDNA探針放射性標(biāo)記對供試樣品中的總RNA和poly(A)+mRNA進(jìn)行Northem印跡和雜交檢驗，來研究脅迫時相關(guān)基因表達(dá)譜的特征。從而系統(tǒng)探討重金屬離子脅迫對兩種草坪草幼苗的生態(tài)毒理效應(yīng)，草坪草在重金屬脅迫響應(yīng)時葉片中ROS形成和積累規(guī)律，以及ROS對細(xì)胞主要抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)作用和ROS物質(zhì)中的部分信使分子對主要抗氧化酶基因表達(dá)的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明： 1.重金屬離子脅迫可

4、造成兩種草坪草生物量積累的顯著下降，其中當(dāng)匍匐翦股穎幼苗分別被含濃度為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L和2.0mmol/L硝酸鎘的營養(yǎng)液處理時，其根系生物量分別比對照下降了3.97％、4.84％和8.96％，其地上莖葉生物量分別比對照下降了1.05％、3.11％和6.66％；被含濃度為0mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L和5.0mmol/L醋酸鉛的營養(yǎng)液處理時，其根系生物量分別比對照下降了8.31

5、％、9.18％、15.53％，其地上莖葉生物量分別比對照下降了0、1.28％、6.72％。 同樣，當(dāng)多年生黑麥草幼苗分別被濃度為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L和2.0mmol/L硝酸鎘處理時，其根系生物量分別比對照下降了2.21％、3.10％和6.54％，其地上莖葉生物量分別比對照下降了0.35％、1.69％和5.24％；被濃度為0mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L和5.0mmol/L醋

6、酸鉛處理時，其根系生物量分別比對照下降了7.44％、8.55％和14.04％，其地上莖葉生物量分別比對照下降了0、0.71％和2.13％。 重金屬離子濃度與草坪草生物量積累之間的回歸分析結(jié)果表明，硝酸鎘處理對草坪草根系的不良影響大于醋酸鉛處理，尤其對草坪草地上莖葉的不良影響10倍于醋酸鉛處理。 重金屬脅迫對草坪草根系的影響主要是引起根尖細(xì)胞分裂能力下降和根系生長發(fā)育受阻，而對莖葉生長的影響主要靠降低光合作用效率和呼吸效率

7、來實現(xiàn)，因而重金屬離子對地上莖葉的影響明顯具有時間上的滯后效應(yīng)。 2.研究表明，重金屬離子處理濃度與草坪草體內(nèi)金屬離子積累量之間具有強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系，金屬離子脅迫持續(xù)時間與草坪草體內(nèi)金屬離子的積累呈現(xiàn)出典型的線型方式增加。而且草坪草體內(nèi)重金屬離子積累受到重金屬離子處理濃度、草坪草根系生長量和金屬離子半徑等因素的共同影響。 當(dāng)匍匐翦股穎幼苗分別被濃度為1.0mmol/L與0.5mmol/L的硝酸鎘溶液處理，與對照比較其幼苗

8、中的重金屬離子含量將由0急劇增加到對照的數(shù)百倍，在處理的第1d、第3d和第6d時，匍匐翦股穎根系內(nèi)鎘離子含量分別上升了41.86％、59.59％和59.44％，其地上莖葉中的金屬離子積累量分別上升了25.89％、18.57％和50.74％;將幼苗用濃度為2.0mmol/L和1.0mmol/L醋酸鉛溶液處理，在處理的第1d、第3d和第6d時其根系內(nèi)鉛離子積累量分別上升了27.00％、31.68％和50.35％，而其地上莖葉中鉛離子積累量上

9、升了2.21％、17.90％和37.62％。 3.研究結(jié)果表明，對分別用0.5mmol/L、1.0mmol/L的硝酸鎘和1.0mmol/L、2.5mmol/L的醋酸鉛，以及用含0.5mmol/L硝酸鎘＋5μmol/L的抗霉素A和1.0mmol/L的醋酸鉛＋5μmol/L的抗霉素A脅迫處理過的草坪草葉片，分別進(jìn)行二氯熒光黃雙乙酸酯(H2DCF-DA)保溫處理后，重金屬離子處理使匍匐翦股穎葉片中DCF上升了6.67～73.04％，使

10、多年生黑麥草葉片中的DCF上升了13.57～70.25％。其中，硝酸鎘處理時匍匐翦股穎葉片中的H2O2含量平均增加了39.78％，使多年生黑麥草中的H2O2含量平均增加了50.00％；醋酸鉛處理時匍匐翦股穎葉片中的H2O2含量平均增加了27.43％，使多年生黑麥草中的H2O2含量平均增加了22.41％。而空白對照抗霉素A處理使匍匐翦股穎葉片中的DCF值增加了2.41倍，使多年生黑麥草葉片中的DCF值增加了2.34倍。重金屬離子脅迫與空白

11、對照處理一樣，具有誘導(dǎo)葉片細(xì)胞產(chǎn)生超量的H2O2等ROS的作用，該研究成果為進(jìn)一步研究重金屬脅迫時產(chǎn)生的ROS物質(zhì)對相關(guān)抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)作用和對部分基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。研究還發(fā)現(xiàn)硝酸鎘處理對草坪草葉片中H2O2的產(chǎn)生效應(yīng)強(qiáng)于醋酸鉛處理，說明重金屬鎘離子對草坪草的毒害作用強(qiáng)于重金屬鉛離子。 4.在重金屬脅迫時，細(xì)胞中的SODs作為細(xì)胞清除ROS的第一道防線，其活性首先受到因重金屬離子脅迫而產(chǎn)生的超氧陰離子(O

12、-2)調(diào)節(jié)，SODs將O-2還原為H2O2后，過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、抗壞酸血酸過氧化物酶(APX)等過氧化物酶(POD)活性開始受到H2O2的調(diào)節(jié)。 當(dāng)匍匐翦股穎幼苗分別用含濃度為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L和2.5mmol/L的硝酸鎘溶液的營養(yǎng)液，0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.5mmol/L、5.0mm

13、ol/L和10.0mmol/L的醋酸鉛溶液的營養(yǎng)液處理后，隨重金屬離子處理濃度的逐漸增加和脅迫時間的延長，匍匐翦股穎根系中SODs活性水平分別比對照增加了9.36％、36.16％、43.35％、20.04％和15.25％。在脅迫處理的第2d根系內(nèi)該酶活性達(dá)到最高，且隨脅迫時間的延長，根系SODs活性急劇下降；同樣，隨醋酸鉛處理濃度增加，其根系中SODs活性也分別比對照增加了7.72％、21.89％、28.33％、19.53％和20.39

14、％，而重金屬鉛離子脅迫處理在第4d其根系SODs活性才達(dá)到最高值，表明重金屬鎘離子對匍匐翦股穎根系SODs活性的影響要大于鉛離子。同樣，根系中CAT活性也隨重金屬離子脅迫濃度和時間的增加發(fā)生變化，隨硝酸鎘處理濃度增加，其CAT活性分別比對照增加了12.34％、19.42％、18.86％、10.79％，但濃度達(dá)到2.5mmol/L時，匍匐翦股穎根系的CAT活性下降了0.09％；用不同濃度的醋酸鉛處理匍匐翦股穎后，其根系中該酶活性分別增加了

15、7.93％、9.82％、12.08％、10.64％和0.51％。在脅迫的第2d其CAT活性達(dá)到高值，并保持到第4d后，該酶活性才開始急劇降低。根系POD活性水平隨硝酸鎘離子脅迫濃度與時間而變化，隨鎘離子脅迫濃度增加，該酶活性也分別比對照增加了3.13％、14.28％、10.30％、5.92％和5.30％，該酶在脅迫的第2d其活性就達(dá)到最高值，然后開始急劇下降；在醋酸鉛脅迫中，該酶活性增加了發(fā)19.28％、21.59％、18.89％、14

16、.78％和9.75％。 另外，研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)重金屬鎘離子處理濃度超過1.5mmol/L時，將引起草坪草根系內(nèi)的SODs、CAT和POD活性水平下降；當(dāng)鉛離子濃度超過2.5mmol/L時，也會使草坪草根系中的SODs、CAT和POD活性水平下降。說明重金屬鎘離子脅迫對草坪草根系中抗氧化酶活性的不良影響要強(qiáng)于重金屬鉛離子脅迫，兩種草坪草根系內(nèi)抗氧化酶活性對重金屬離子脅迫中產(chǎn)生的ROS物質(zhì)的清除效率，以及適應(yīng)性表現(xiàn)具有差異。相對而言，匍

17、匐翦股穎對脅迫的適應(yīng)性強(qiáng)于多年生黑麥草，不同草坪草草種對逆境形成的ROS物質(zhì)的適應(yīng)能力及其細(xì)胞內(nèi)對ROS物質(zhì)的清除效率，以及與它們對各種逆境的抗性關(guān)系，有待于將來作進(jìn)一步研究。 5.重金屬脅迫中產(chǎn)生的ROS對部分抗氧化酶基因的表達(dá)產(chǎn)生積極影響，研究表明在重金屬離子脅迫下，草坪草根系細(xì)胞內(nèi)的Mn-Sod、Cat、Apx和Gpx基因的表達(dá)均強(qiáng)于對照，說明重金屬離子脅迫對上述抗氧化酶基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。在對不同脅迫時間段內(nèi)抗氧化酶