匍匐翦股穎離體再生體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化研究;匍匐翦股穎na39;h39;反向轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆

1、分類號：一 密級：，單位代碼：一10 6 9 1學(xué) 號： ! Q Q ! ! 1 9 1 1西北大學(xué)碩士學(xué)位論文題目：囪塑蔓壁題塞簽?zāi)久僳栈属~逮堡掛垡塑塞；一囪塑蔓照塑盟壘：』旦：區(qū)魚掛重量魚叁固煎盤隆作者：皇j 整一指導(dǎo)教師： 盆至塑 專業(yè)技術(shù)職務(wù)： 塑撞學(xué)科( 專業(yè)) ：—— 紐照生塹堂答辯日期： ! ! ! ! 生i 旦 學(xué)位授予日期：二零零七年性愈傷組織誘導(dǎo)、體細胞胚發(fā)生及植株再生研究，旨在為進一步利用現(xiàn)代遺傳工程技術(shù)改良

2、匍匐翦股穎品質(zhì)、培育新品種提供實驗基礎(chǔ)。本研究利用成熟種子作為外植體，分析了2 ，4 D 對匍匐翦股穎胚性愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的影響，并對體細胞胚的發(fā)生過程進行了觀察。實驗結(jié)果表明，附加2 ．0 l n g ／L 2 , 4 - D 、0 ．1 t o g a _ , 6 - B A 時胚性愈傷組織的誘導(dǎo)頻率最高。隨著2 ，4 - D濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)和分化能力明顯下降。在再生過程中采用1 ．0m g ／L的6 ．B A i

3、大至0 了比較好的效果，大部分實驗中愈傷組織的再生頻率達到9 0 ％以上。同時發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高肌醇濃度可以使苗長得較為粗壯。在實驗中還對匍匐翦股穎的體細胞胚發(fā)生過程進行了觀察，發(fā)現(xiàn)匍匐翦股穎的體細胞胚發(fā)生要經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚等不同階段。分別以0 ．6 t o o 帆和0 ．4 m o l ／L l 時露醇高滲處理5 , b 時和1 2 個小時的匍匐翦股穎胚性愈傷組織為目標(biāo)材料，利用P D S l 0 0 0 ／H e 基因槍

4、和根癌農(nóng)桿菌( A g r o b a c t e r i u mr u m P 勵c i e n s ) L B A 4 4 0 4 菌株進行遺傳轉(zhuǎn)化，目的基因為N 棚+ 反向轉(zhuǎn)運蛋白基因A t N H X l 。所用質(zhì)粒p H Z X l F h p B l l 2 1 改造而來，克隆有擬南芥N a Ⅵr 反向轉(zhuǎn)運蛋白基[ 1 I A t N H X l 和選擇標(biāo)記基因n p t I I ，上游為C a M V 3 5 S 啟動子，

5、下游為N O S 終止子。將轉(zhuǎn)化過的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至附加1 0 0 m g 脯酸卡那霉素的培養(yǎng)基上進行分化，分別獲得6 株( 基因槍法) 和3 株( 農(nóng)桿菌法) 綠茁。對獲得的綠苗進行P C R檢測，發(fā)現(xiàn)分別有一株( 基因槍法) 和兩株( 農(nóng)桿菌法) 綠苗可以擴增出相應(yīng)條帶，初步鑒定為轉(zhuǎn)基因植株。2 ．N a + ／H + 反向轉(zhuǎn)運蛋白基因序列的克隆與分析N a + m + 反向轉(zhuǎn)運蛋白與植物的耐鹽性有密切的關(guān)系。在高等植物體內(nèi)，液泡膜

6、N a + ／H + 反向轉(zhuǎn)運蛋白主要負責(zé)把N a + 區(qū)隔化至液泡中。植物的N a Ⅶ+ 反向轉(zhuǎn)運蛋白基因具有很高的保守性，根據(jù)已經(jīng)報道的液泡膜N a Ⅶ+ 反向轉(zhuǎn)運蛋白基因的保守序列設(shè)計簡并引物，可以從其它物種中分離同源基因。本工作首先提取翦股穎總R N A 并反轉(zhuǎn)錄合成e D N A 第一鏈，然后采用簡并引物通過梯度P C R技術(shù)擴增出匍匐翦股穎液泡膜N a 佃+ 反向轉(zhuǎn)運蛋白e D N A 的中間序列，大小約3 0 0 b p