農(nóng)桿菌介導rd29A啟動子驅動AVP1基因轉化匍匐翦股穎的研究.pdf

1、隨著我國草坪業(yè)的快速發(fā)展，草坪草遺傳育種工作越來越受到人們關注，生物技術在草坪草品種改良中具有很大的應用潛力。干旱和高鹽是限制草坪草生長的主要環(huán)境因子，當前我國特別缺乏抗旱耐鹽的草坪草品種。利用植物基因工程技術，克隆并轉化抗旱耐鹽基因，使其在草坪草中表達，可以明顯加快耐鹽抗旱新品種的選育，具有廣闊的應用前景。 擬南芥液泡質子焦磷酸酶Arabidopsis Vacuolar H<'+>-Pyrophosphatase(AVP1)通

2、過調節(jié)液泡膜兩側的質子梯度，控制植物生長激素的運輸，隨之影響依賴生長素的各種發(fā)育事件，使植物在高鹽和干旱脅迫下產(chǎn)生適應性。擬南芥rd29A(Resoonsiveto Dehydration，rd29A)啟動子是脅迫誘導型啟動子，能在干旱、低溫和高鹽條件驅動下游基因表達。本文運用農(nóng)桿菌介導法將從擬南芥中克隆的AVP1基因轉入匍匐翦股穎，在誘導型的rd29A啟動子驅動下進行表達，并對獲得的轉基因匍匐翦股穎進行抗旱耐鹽生理測定，獲得了抗旱耐鹽

3、性增強的草坪草。 主要實驗結果如下： 1、建立了草坪草的愈傷組織遺傳轉化受體系統(tǒng)。以冷季型草坪草匍匐翦股穎和高羊茅的種子作為外植體，愈傷組織誘導率分別為53.0±8.7％和60.7±7.9％，均能誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織，胚性愈傷組織生長穩(wěn)定，繼代一個月后生長速率可達206.0±43.7％和159.3±34.4％。而暖季型草坪草狗牙根以種子作為外植體的愈傷組織誘導率僅為14.7±4.0％，且只產(chǎn)生非胚性愈傷組織，該愈傷組織生

4、長速率為78.4±23.2％；以狗牙根的節(jié)作為外植體可以誘導出胚性愈傷組織，但數(shù)次繼代后轉為非胚性愈傷組織。 2、通過農(nóng)桿菌介導法將rd29A啟動子驅動AVP1基因的pCambia1302表達載體轉入匍匐翦股穎。分別用濃度為50、75、100mg/L潮霉素篩選轉化愈傷組織，三種濃度的篩選率為64.1±5.0％、81.5±1.5％和33.3±3.8％。經(jīng)過一個半月的篩選，50mg/L潮霉素篩選后的轉化愈傷的hpt-PCR陽性植株比

5、率僅為0.9％，75mg/L濃度下的分化植株hpt-PCR陽性比率高達96.7％。因此，確定75mg/L為匍匐翦股穎轉化愈傷的最佳篩選濃度。 3、轉基因匍匐翦股穎植株的PCR鑒定。獲得再生匍匐翦股穎植株90株，其中hpt-PCR陽性株87株，陽性比率為96.7％；AVP1-PCR.陽性株13株，陽性比率為14.4％。 4、轉基因匍匐翦股穎愈傷組織中AVP1基因表達的RT-PCR檢測。結果顯示，在正常培養(yǎng)條件下轉基因愈傷A

6、VP1基因微量表達，而在干旱(干燥48h)、低溫(4℃，24h)或高鹽(200mM NaCl)脅迫下AVP1基因的表達均明顯增強；未轉基因的野生型材料中，無論處理與否均未檢測到AVP1基因的表達。該結果表明在非脅迫條件下rd29A啟動子的活性很低，而在干旱、低溫或高鹽處理條件下活性明顯增強，從而啟動其下游基因AVP1的表達。由此驗證了干旱、低溫和高鹽條件能促進轉基因匍匐翦股穎中目的基因AVP1的表達水平。 5、轉基因匍匐翦股穎愈

7、傷組織的抗性生理分析。經(jīng)干燥處理2天和3天后，轉基因愈傷組織的恢復生長速率為645％和543％，野生型的為423％和135％，可見轉基因匍匐翦股穎比野生型具有更強的耐旱性；在高鹽脅迫下，用0-200 mM不同濃度NaCl處理的轉基因愈傷，其生長速率均高于相同情況下的野生型愈傷。尤其是在NaCI濃度分別為50mmol/L，200mmol/L時兩者的差異較大，分別相差170％和148％。表明轉AVP1基因的匍匐翦股穎的高鹽耐受性增強。

8、 6、轉基因匍匐翦股穎植株的抗性生理分析。經(jīng)過9天的干旱脅迫后，轉基因翦股穎小苗葉片為鮮綠色，而野生型草葉片則明顯萎焉變黃。對干旱處理前后小苗相對含水量進行測定，干旱處理前轉基因和野生型翦股穎小苗的含水量差異不明顯，而干旱脅迫后轉基因翦股穎的含水量為82.6％，明顯高于野生型的77.5％，說明轉基因匍匐翦股穎比野生型耐旱。轉基因植株根的生物量測定結果顯示，轉基因植株根的干重平均為0.17±0.02g，而野生型植株平均只有0.07±0.