DREB1B和RD29A啟動(dòng)子的克隆、載體構(gòu)建及康乃馨和雛菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、DREB1B轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控一組抗干旱、抗低溫基因的表達(dá)，在植物傳遞脅迫耐受性上扮演重要的角色。而RD29A啟動(dòng)子中包含著干旱、高鹽和低溫響應(yīng)順式作用元件，僅在脅迫誘導(dǎo)下表達(dá)。已經(jīng)有利用導(dǎo)入RD29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DREB1B轉(zhuǎn)錄因子來提高植物抗寒性、抗旱性，并且獲得一定成功的報(bào)道，但在花卉植物上的應(yīng)用還有待探討。本實(shí)驗(yàn)擬通過克隆抗逆基因DREB1B及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A.L和RD29A.S，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-RD29A.L-DRE

2、B1B和pBI121-RD29A.S-DREB1B轉(zhuǎn)化康乃馨、雛菊、三色堇等花卉植物而獲得抗逆性強(qiáng)的花卉新品系，以便擴(kuò)大其種植范圍，延長開花時(shí)間，增加其經(jīng)濟(jì)效益。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1、擬南芥抗逆基因DREB1B和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A的克隆及鑒定：根據(jù)Genebank中DREB1B全序列，設(shè)計(jì)含有XbaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增長度為747bp；根據(jù)RD29A全序列，設(shè)計(jì)了兩對引物擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，含有XbaⅠ和Hi

3、ndⅢ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增長度分別為RD29A.L∶1015bp，RD29A.S∶548bp。經(jīng)過PCR和RT-PCR反應(yīng)，成功克隆到RD29A.L和RD29A.S長度不同的兩種啟動(dòng)子和DREB1B，用于下一步的載體構(gòu)建。
　　 2、pBI121-RD29A.L-DREB1B和pBI121-RD29A.S-DREB1B載體構(gòu)建：pBI121載體、DREB1B、RD29A.L和RD29A.S分別進(jìn)行同步雙酶切，產(chǎn)物純化后用T4 DNA連

4、接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行菌落PCR、提質(zhì)粒酶切和測序鑒定，確定RD29A啟動(dòng)子和DREB1B序列正確，可以發(fā)揮其相應(yīng)功能。然后將重組子轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定成功構(gòu)建了表達(dá)載體pBI121-RD29A.L-DREB1B和pBI121-RD29A.S-DREB1B。
　　 3、康乃馨和雛菊離體再生體系的建立：以下胚軸和腋芽作為外植體，通過愈傷組織、不定芽和不定根的誘導(dǎo)，成功建立了康乃

5、馨的再生體系。以葉片作為外植體，在MS+1.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生了雛菊的不定芽，生根培養(yǎng)正在進(jìn)行中。
　　 由此，我們成功構(gòu)建了pBI121-RD29A.L-DREB1B和pBI121-RD29A.S-DREB1B真核表達(dá)載體，并逐步建立了花卉植物的再生體系，這為下一步農(nóng)桿菌介導(dǎo)的RD29A.L-DREB1B和RD29A.S-DREB1B基因的遺傳轉(zhuǎn)化以及篩選出具有抗寒、抗旱、抗鹽功能的花卉新