如何構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)化體檢測(cè)

1、如何構(gòu)建載體1啟動(dòng)子的選用和改造外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問(wèn)題。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來(lái)自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源

2、基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng)子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子

3、、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等。這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。例如，瑞士CIBAGEIGY公司使用PRIA啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因煙草中Bt毒蛋白基因的表達(dá)，由于該啟動(dòng)子可受水楊酸及其衍生物誘導(dǎo)，通過(guò)噴酒廉價(jià)、無(wú)公害的化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)抗蟲基因在蟲害重發(fā)生季節(jié)表達(dá)，顯然是一個(gè)十分有效的途徑。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，使用天然的啟動(dòng)子往往不能取得令人滿意的結(jié)果，尤其是在進(jìn)行特異表達(dá)

4、和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，表達(dá)水平大多不夠理想。對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動(dòng)子將是十分重要的途徑。例如，Ni等人將章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)與甘露堿合成酶基因啟動(dòng)子構(gòu)成了復(fù)合啟動(dòng)子，GUS表達(dá)結(jié)果表示：改造后的啟動(dòng)子活性比35S啟動(dòng)子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導(dǎo)型的PIII基因啟動(dòng)子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進(jìn)行組合，新型啟動(dòng)子的表達(dá)活性提高了近10倍（專利）。在植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動(dòng)子發(fā)揮了重要作用。2增強(qiáng)翻譯

5、效率為了增強(qiáng)外源基因的翻譯效率，構(gòu)建載體時(shí)一般要對(duì)基因進(jìn)行修飾，主要考慮三方面內(nèi)容：2.1添加5｀3｀非翻譯序列許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，真核基因的5｀3｀非翻譯序列（UTR）對(duì)基因的正常表達(dá)是非常必要的，該區(qū)段的缺失常會(huì)導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒是造成一種分割作用，使每個(gè)轉(zhuǎn)錄單元保持相對(duì)的獨(dú)立性，免受周圍染色質(zhì)的影響。有關(guān)研究表明，將MAR置于目的基因的兩側(cè)，構(gòu)建成包含MARgeneMAR結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，

6、用于遺傳轉(zhuǎn)化，能明顯提高目的基因的表達(dá)水平，降低不同轉(zhuǎn)基因植株之間目的基因表達(dá)水平的差異，減少位置效應(yīng)。例如，Allen等人研究了異源MAR（來(lái)自酵母）和同源MAR（來(lái)自煙草）對(duì)Gus基因在煙草中表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)酵母的MAR能使轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平平均提高12倍，而煙草本身的MAR能使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平平均提高60倍。使用來(lái)源于雞溶菌酶基因的MAR也可起到同樣作用。另一可行的途徑是采用定點(diǎn)整合技術(shù)，這一技術(shù)的主要原理是，當(dāng)轉(zhuǎn)化載體含有與寄主染色

7、體同源的DNA片段時(shí)，外源基因可以通過(guò)同源重組定點(diǎn)整合于染色體的特定部位。實(shí)際操作時(shí)首先要分離染色體轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的DNA片段，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點(diǎn)整合已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，在動(dòng)物中外源基因的定點(diǎn)整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合以外，細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中還很少有成功的報(bào)道。4構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體為了克服細(xì)胞核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常出現(xiàn)的外源基因表達(dá)效率低，位置效應(yīng)及由于核基因隨花粉擴(kuò)散而帶來(lái)的不安全性

8、等問(wèn)題，近幾年出現(xiàn)的一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)葉綠體轉(zhuǎn)化，正以它的優(yōu)越性和發(fā)展前景日益為人們所認(rèn)識(shí)并受到重視。到目前為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發(fā)表）5種植物中相繼實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化，使得這一轉(zhuǎn)化技術(shù)開始成為植物基因工程中新的生長(zhǎng)點(diǎn)。由于目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測(cè)定，這就為外源基因通過(guò)同源重組機(jī)制定點(diǎn)整合進(jìn)葉綠體基因組奠定了基礎(chǔ)，目前構(gòu)建的葉綠體表達(dá)載體基本上都屬于定點(diǎn)整合載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體基本上

9、都屬于定點(diǎn)事例載體。構(gòu)建葉綠體表達(dá)載體時(shí)，一般都在外源基因表達(dá)盒的兩側(cè)各連接一段葉綠體的DNA序列，稱為同源重組片段或定位片段（Targetingfragment）。當(dāng)載體被導(dǎo)入葉綠體后，通過(guò)這兩個(gè)片段與葉綠體基因組上的相同片段發(fā)生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)。在以作物改良為目的的葉綠體轉(zhuǎn)化中，要求同源重組發(fā)生以后，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致于破壞插入點(diǎn)處原有基因的功能。為滿足這一要求

10、，已有的工作都選用了相鄰的兩個(gè)基因作為同源重組片段，例如rbcLaccD，16StrnVrpsl2rps7psbAtrnKrps7ndhB。當(dāng)同源重組發(fā)生以后，外源基因定點(diǎn)插入在兩個(gè)相鄰基因的間隔區(qū)，保證了原有基因的功能不受影響。最近，Daniel等利用煙草葉綠體基因trnA和trnI作為同源重組片段，構(gòu)建了一種通用載體（universalvect）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者認(rèn)為這種載體可用于多種