水稻銅誘導(dǎo)金屬硫蛋白OsMT2c的功能研究.pdf

1、近年來，環(huán)境中的重金屬污染日趨嚴(yán)重，重金屬對(duì)土壤和水體的污染已經(jīng)成為全球性的環(huán)境問題之一。植物在長期的進(jìn)化過程中形成了獨(dú)特的抵御重金屬脅迫的反應(yīng)機(jī)制，既要保持生理必需元素的濃度，又要避免非必需重金屬的毒害。對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的金屬離子最有效的解毒機(jī)制是螯合作用，胞質(zhì)中能與重金屬結(jié)合的有機(jī)化合物包括有機(jī)酸、氨基酸等小分子物質(zhì)及植物螯合肽(phytochelatins，PCs)、金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)等，它

2、們與金屬結(jié)合后可降低重金屬離子毒性。MTs是一類低分子量、富含半胱氨酸的小肽，在重金屬解毒、維持細(xì)胞內(nèi)的金屬離子穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ROS平衡中發(fā)揮重要的作用。本文篩選到了水稻金屬硫蛋白家族基因中對(duì)Cu和H2O2處理均顯著上調(diào)的OsMT2c，分析了其受Cu誘導(dǎo)表達(dá)過程中可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并將該基因轉(zhuǎn)入到擬南芥和水稻中，研究了過表達(dá)OsMT2c對(duì)植物重金屬的耐性及積累的影響。
　　通過MSU水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫和NCBI的聯(lián)合搜索確

3、認(rèn)水稻金屬硫蛋白家族中含有14個(gè)成員，分布在水稻6條染色體中，并分屬于植物四類MTs(Type-1，Type-2，Type-3和Type-4)。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)除了OsMT4有三個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)外，其他OsMTs均含有兩個(gè)CRD分別位于肽鏈N端和C端。其中Type-1 MTs有7個(gè)成員，主要在根系中表達(dá)，Type-2和Type-3 MTs在營養(yǎng)生長和種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量較高，而Type-4MTs在各組織中的表達(dá)量均較

4、低。進(jìn)一步利用GEO公共芯片數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對(duì)水稻不同組織的各個(gè)生長發(fā)育時(shí)期，多種生物和非生物脅迫處理以及外源植物激素處理下的OsMTs的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果分別繪制成熱圖，發(fā)現(xiàn)MT家族的表達(dá)具有明顯的組織特異性和可誘導(dǎo)性。本文還利用半定量RT-PCR分析了水稻幼苗和種子，以及Cu、H2O2及水楊酸處理下部分OsMTs基因的表達(dá)情況，并由此篩選到了同時(shí)受重金屬Cu和H2O2誘導(dǎo)的一個(gè)水稻MT基因，OsMT2c。
　　過量Cu不僅使水稻

5、幼苗快速連續(xù)的產(chǎn)生并釋放H2O2，同時(shí)Cu還誘導(dǎo)OsMT2c基因表達(dá)顯著上調(diào)。通過外源施加H2O2清除劑N，N'-二甲基硫脲(DMTU)和抗壞血酸(Asc)，可有效降低Cu誘導(dǎo)的H2O2積累，同時(shí)也抑制了Cu誘導(dǎo)的OsMT2c的表達(dá)。進(jìn)一步利用水稻突變體osapx2研究發(fā)現(xiàn)，該突變體的內(nèi)源H2O2含量顯著高于野生型，而突變株根系和葉片中OsMT2c的表達(dá)量也分別顯著地高于野生型。雖然Cu處理下osapx2突變體中H2O2積累沒有進(jìn)一步的

6、增加，但是OsMT2c在該突變體中的表達(dá)也沒有受Cu誘導(dǎo)而進(jìn)一步上調(diào)。以上結(jié)果表明銅誘導(dǎo)OsMT2c的上調(diào)表達(dá)是通過銅誘導(dǎo)的H2O2的產(chǎn)生和積累實(shí)現(xiàn)的，OsMT2c可能是H2O2信號(hào)途徑中的下游蛋白。
　　在擬南芥中異源表達(dá)OsMT2c可明顯提高植株的耐銅性，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因擬南芥能在含35μmol L-1 CuSO4的培養(yǎng)基上正常生長，根長和鮮重受Cu的影響降低。相反，野生型擬南芥在相同CuSO4濃度處理下根系伸長明顯受阻，鮮重降低

7、。在銅和氧化脅迫處理下，過表達(dá)OsMT2c的擬南芥在銅和氧化脅迫處理下葉片中H2O2的積累明顯少于野生型和轉(zhuǎn)空載體型，說明OsMT2c增強(qiáng)了植物清除ROS的能力。正常水培條件下轉(zhuǎn)OsMT2c擬南芥中銅積累量與野生型和轉(zhuǎn)空載體型無明顯差異;而在10μmolL-1 CuSO4處理下地上部銅積累量則是轉(zhuǎn)基因植株顯著低于野生型和轉(zhuǎn)空載體型。
　　為了進(jìn)一步分析OsMT2c的功能，將過量表達(dá)OsMT2c的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-

8、OsMT2c轉(zhuǎn)化水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織，分別獲得了轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞和幼苗。OsMT2c增加了水稻懸浮細(xì)胞對(duì)Zn、Mn、Fe等必需金屬元素的積累，而不影響對(duì)Cu的積累;在Cu脅迫處理后轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞比野生型積累了更多的Cu、Mn和Fe，而對(duì)Zn的積累增加不顯著。過表達(dá)OsMT2c水稻轉(zhuǎn)基因幼苗的根系發(fā)育異常，根長變短，不定根數(shù)目增加;銅處理?xiàng)l件下過表達(dá)OsMT2c水稻與野生型相比，根系細(xì)胞活力增加，根系H2O2積累減少，地上部銅的積累量降