王漿蛋白酶解技術(shù)和AccMRJP5基因重組表達(dá)及產(chǎn)物活性研究.pdf

1、蜂王漿(royal jelly)是蜜蜂哺育工蜂頭部王漿腺分泌的乳狀物,是1-3日齡工蜂幼蟲及蜂王終身所食用的食料,具有抗疲勞、預(yù)防腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種營養(yǎng)保健功能和生理活性。蜂王漿的神奇功效與它所含有的活性成分密不可分,其中蛋白質(zhì)是重要的營養(yǎng)成分,蛋白質(zhì)中的可溶性蛋白又稱為王漿主蛋白MRJPs(major royal jellyproteins),國內(nèi)外研究己部分證實(shí)MRJPs可能是蜂王漿中的重要營養(yǎng)及生理調(diào)節(jié)因子。
　　 本研

2、究首先利用生物酶解技術(shù),通過對(duì)pH、水解時(shí)間和酶濃度等酶解工藝條件的優(yōu)化,得到王漿蛋白水解的最佳條件:37℃下王漿水溶性蛋白,先后用1％(w/w)的胃蛋白酶在pH=2.0和胰蛋白酶在pH=7.5的條件下水解4 h。在上述條件下水解得到王漿蛋白水解產(chǎn)物(H-MRJPs)的水解度為28.7％,總氮回收率為35.5％。利用超濾技術(shù)對(duì)H-MRJPs進(jìn)行初步分離純化,活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)分子量小于1 kDa的肽組分是H-MRJPs中起抗氧化作用和降壓作用

3、的主要物質(zhì),其抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的半抑制濃度(IC50)達(dá)到0.67 mg pro/mL。
　　 其次,本研究構(gòu)建了pPIC9K-AccMRJP5重組穿梭載體,將pPIC9K-AccMRJP5線性化,電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115(Pichia pasloris GS115)中。采用添加G418抗生素的培養(yǎng)基,對(duì)重組酵母多拷貝表達(dá)菌株篩選,得到6個(gè)陽性高表達(dá)菌株。對(duì)高表達(dá)菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳

4、分析,發(fā)現(xiàn)在100 kDa處出現(xiàn)特異性條帶;采用GST-AccMRJP1多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析,顯示特異性免疫印跡,表明AccMR2P5基因在酵母菌中表達(dá)成功。對(duì)重組表達(dá)的AccMRJP5作去糖基化酶處理和處理產(chǎn)物SDS-PAGE分析,顯示分子量由100 kDa降低到69 kDa,表明表達(dá)產(chǎn)物屬于糖基化蛋白。對(duì)AccMRJP5表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化,得到了純化蛋白。對(duì)AccMRJP5表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),證實(shí)可