海地瓜蛋白酶解物Plastein反應(yīng)修飾及其ACE抑制活性研究.pdf

1、降血壓肽是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制劑，可通過抑制人體血管緊張素Ⅱ的生成而達(dá)到降低血壓的目的。降血壓肽毒副作用低、降壓效果明顯、來源廣泛，已成目前研究的熱點。但是，蛋白質(zhì)酶解制備的ACE抑制肽大多活性較低，這已成為酶法制備的ACE抑制肽研究與開發(fā)的瓶頸，Plastein反應(yīng)修飾是改善多肽ACE抑制活性的新途徑。本文以海地瓜蛋白酶解物為原料，探究Plastein反應(yīng)修飾對ACE抑制活性的影響，并從Plastein反應(yīng)修飾產(chǎn)物中純化出高活性的A

2、CE抑制肽，鑒定其序列結(jié)構(gòu)。
　　 本文主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.采用復(fù)合酶酶解海地瓜體壁蛋白，得到具有降血壓活性的酶解物，利用Plastein反應(yīng)進行修飾，考察酶的種類、底物濃度、溫度、酶添加量對Plastein反應(yīng)的影響，得到不同修飾程度的產(chǎn)物，測定其ACE抑制活性。結(jié)果顯示經(jīng)過Plastein反應(yīng)修飾后，顯著提高了酶解液的ACE抑制活性。體系中游離氨基的減少量呈不規(guī)則變化，修飾產(chǎn)物的IC50值也呈不規(guī)則下降，其

3、中反應(yīng)1 h和4 h的修飾產(chǎn)物IC50值最低，分別是0.62 mg/L和0.75 mg/L。分析體系中游離氨基酸的組成，發(fā)現(xiàn)脯氨酸的結(jié)合能顯著提高海地瓜體壁蛋白酶解物的ACE抑制活性。
　　 2.以海地瓜蛋白酶解物為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了Plastein反應(yīng)條件，得到海地瓜蛋白酶解物Plastein反應(yīng)最佳條件是：底物濃度40.71％、溫度47.75℃、酶添加量2.47kU/g蛋白，該條件下反應(yīng)6 h后體系中游離氨基酸減少量為

4、0.462mmol/g pro。
　　 3.在Plastein反應(yīng)中添加外源Tyr、Pro、Trp、Phe和Leu，探究外源氨基酸存在下。Plastein反應(yīng)對ACE抑制活性的影響。在適宜條件下，改變反應(yīng)時間得到不同程度的Plastein反應(yīng)修飾產(chǎn)物，并測定它們的IC50值。結(jié)果表明，添加Pro的效果最佳，活性測定顯示，ACE抑制活性隨修飾程度呈不規(guī)則變化。1 h(0.59 mg/mL)和4 h(0.63 mg/mL)達(dá)到最低，

5、相比酶解原液(0.89 mg/mL)有顯著提高(p<0.05)。反應(yīng)體系游離氨基酸分析表明，體系中游離脯氨酸在反應(yīng)后顯著降低，反應(yīng)1h后從酶解原液的0.29g/(100mL)降低到0.23g/(100mL)，4h降低到0.2 g/(100mL)，說明脯氨酸有可能結(jié)合到肽鏈中，從而顯著提高了修飾產(chǎn)物的ACE抑制活性。
　　 4.利用Sephadex G-15凝膠柱層析、反相高效液相色譜等技術(shù)對Plastein反應(yīng)修飾產(chǎn)物進行分離純

6、化，獲得了兩條降血壓活性肽，其氨基酸序列分別為PNVA、PNLG，推斷為Plastein合成的產(chǎn)物?；瘜W(xué)合成活性肽PNVA、PNLG、NVA、NLG并測定其活性，結(jié)果顯示，PNVA的活性(8.18μM)顯著高于NVA的活性(12.69μM)，PNLG的活性(12.16μM)顯著高于NLG的活性(17.45μM)。Plastein反應(yīng)修飾得到的含有脯氨酸的降血壓肽的活性顯著高于不含脯氨酸的肽(p<0.05)，說明脯氨酸的引入提高了其ACE