環(huán)境廢物凈化芽孢桿菌的篩選及其代謝特性初步研究【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　環(huán)境廢物凈化芽孢桿菌的篩選及其代謝特性初步研究 </p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物工程 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄&

3、lt;/b></p><p><b>　　中英文摘要</b></p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1 材料和方法2</b></p><p><b>　　1.1 材料2</b></p><p

4、>　　1.1.1 樣品來源2</p><p>　　1.1.2 原料2</p><p>　　1.1.3 儀器設備4</p><p>　　1.1.4 主要培養(yǎng)基及試劑配制4</p><p><b>　　1.2 方法5</b></p><p>　　1.2.1 菌株分離純化和保存5<

5、;/p><p>　　1.2.2 菌株最適生長溫度與pH測定6</p><p>　　1.2.3 菌株鑒定6</p><p>　　1.2.4 試驗菌的代謝特性初步實驗6</p><p>　　1.2.5 試驗菌的纖維素蛋白質分解能力測定7</p><p><b>　　2 結果和分析8</b><

6、;/p><p>　　2.1 菌株篩選8</p><p>　　2.2 最適生長溫度與pH探索9</p><p>　　2.2.1 最適生長溫度測定9</p><p>　　2.2.2 最適生長pH測定9</p><p>　　2.3 菌株的鑒定10</p><p>　　2.4 試驗菌的代謝特性初步

7、實驗10</p><p>　　2.4.1 酪素分解實驗10</p><p>　　2.4.2 色氨酸分解實驗10</p><p>　　2.4.3 油脂分解實驗10</p><p>　　2.4.4 過氧化氫分解實驗11</p><p>　　2.4.5 淀粉分解實驗12</p><p>　

8、　2.5 試驗菌的纖維素蛋白質分解能力測定12</p><p>　　2.5.1 纖維素分解實驗12</p><p>　　2.5.2 酪蛋白分解實驗13</p><p><b>　　3 討論13</b></p><p><b>　　4 結論14</b></p><p>

9、;<b>　　5 建議14</b></p><p><b>　　致謝14</b></p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p><b>　　附錄17</b></p><p>　　摘要：為探索自然界中芽孢桿菌在環(huán)境廢物凈化方面和有

10、機物分解代謝能力方面的特性。從環(huán)境樣品中分離并鑒定得到三株實驗用芽孢桿菌Y1、Z1、Z2，經(jīng)過最適生長條件探索后確定三株菌最適生長溫度分別為32℃、32℃、37℃，最適生長pH值分別為7、7、7.5。后在此基礎上對其一些產(chǎn)酶特性作了初步的定性與定量探索。主要包括對酪素、色氨酸、油脂、過氧化氫和淀粉代謝的定性實驗以及對纖維素、酪蛋白分解特性的定量實驗。結果表明，三株菌均可分解油脂、過氧化氫，對色氨酸均無代謝能力，淀粉透明圈比值分別為1.8

11、23，1.168，1.826。Y1、Z2菌株纖維素酶活力分別為21034U/g與17370U/g，Z1菌株無分解纖維素能力；Z1、Z2菌株酪蛋白酶活力分別為11.15U/g與3.92U/g，Y1菌株無分解酪蛋白能力。</p><p>　　關鍵詞：芽孢桿菌;分離純化；代謝特性</p><p>　　Abstract: This study is to explore Bacillus，abil

12、ity of purifying environmental waste and decomposing organic matter. Three strains of Bacillus, named as Y1, Z1 and Z2 were obtained and identified, which were isolated from environmental samples. After exploring the op

13、timal growth conditions, the optimum growth temperature of the three strains of bacteria was 32 ℃, 32 ℃, 37 ℃, the optimum growth pH values ??were 7,7,7.5. On this basis, preliminary qualitative and quantitative to expl

14、ore the char</p><p>　　Key words: Bacillus，Purification ，Metabolic characteristics</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　芽孢桿菌是一群需氧或兼性厭氧、G +(目前發(fā)現(xiàn)有G一的)并在一定條件下可形成芽孢的化能異常桿菌[1][2]。它們廣泛分

15、布于空氣粉塵[3]、土壤[4]、水[5]及動物腸道[6]中，在各個空間各個領域發(fā)揮著自己的作用。</p><p><b>　　A．芽孢桿菌的分類</b></p><p>　　90年代以來，芽孢桿菌的分類已由原來的2個屬發(fā)展到目前的13個屬，130多個種。</p><p>　　13個屬分別為芽孢桿菌屬（72種）、芽孢乳桿菌屬（5種）、兼性芽孢桿菌

16、屬（1種）、硫化芽孢桿菌屬（3種）、耐熱芽孢桿菌屬（1種）、脂不酸芽孢桿菌屬（4種）、類芽孢桿菌屬（27種）、喜鹽芽孢桿菌屬（3種）、短芽孢桿菌屬（10種）、解硫胺素芽孢桿菌屬（3種）、枝芽孢桿菌屬（2種）、需鹽芽孢桿菌屬（1種）、薄壁芽孢桿菌屬（2種）。</p><p>　　其中后八個屬是1992年到1999年間從芽孢桿菌屬中獨立出來的新屬 [2] 。</p><p><b>

17、　　B．芽孢桿菌的芽孢</b></p><p>　　芽孢是某些細菌在一定條件下，細胞質高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強的球形或橢球形的休眠體。它們對不良環(huán)境如高溫、低溫、干燥、光線和化學藥物有很強的抵抗力。細菌的營養(yǎng)細胞在70～80℃時10min就會死亡，而芽孢在120～140℃情況下還能生存幾個小時，營養(yǎng)細胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢卻能存活15d，芽孢的大多數(shù)酶處于不活動狀態(tài)，代謝活力極低

18、，所以，芽孢是抵抗外界不良環(huán)境的休眠體。</p><p>　　一般認為，芽孢是在生長后期、營養(yǎng)物質缺乏時形成的，因而是適應不良環(huán)境的產(chǎn)物。但實際上，可能不完全如此。決定芽孢形成的根本原因在于細菌內部，細菌染色體上有控制芽孢形成的基因。細菌在營養(yǎng)生長中，這些基因通常不表達，它們可能被一個阻遏體系所控制，一旦這一阻遏消除，就可導致芽孢形成。芽孢形成是一個極其復雜的過程，包括形態(tài)結構、化學成分等多方面變化。</p

19、><p>　　芽孢作為芽孢桿菌的特有結構，因其特點可有很多用途。如其可用于分類鑒定，是因為不同細菌的芽孢具有不同的特點，從形狀、大小、表面特征，直到與菌體的關系等都有不同的表現(xiàn)，可以作為分類鑒定的依據(jù)或參考?？捎糜诳蒲胁牧?，由于芽孢獨特的產(chǎn)生方式，成為研究形態(tài)發(fā)生和遺傳控制的好材料。還可以用作保存菌種和分離菌種，因芽孢對不良環(huán)境有很強的抵抗力，可以保持生命力達數(shù)十年之久，在自然界使細菌度過惡劣的環(huán)境，在實驗室是保存菌

20、種的好材料；而且芽孢的耐熱性有助于芽孢細菌的分離，將含菌懸浮液進行熱處理，殺死所有營養(yǎng)細胞，可以篩選出形成芽孢的細菌種類。其他方面還有些可用于生物殺蟲，有些芽孢細菌在產(chǎn)生芽孢的同時，可以產(chǎn)生一種雙錐形的結晶內含物，稱為伴孢晶體，這是一種蛋白質毒素，可以殺死某些昆蟲（特別是鱗翅目）的幼蟲。</p><p><b>　　C．芽孢桿菌的產(chǎn)酶</b></p><p>　　芽孢

21、桿菌可產(chǎn)生多種多樣的酶，如蛋白酶[7][8]、纖維素酶[9]、淀粉酶[8]、脂肪酶[10]、過氧化氫酶[7]等等。同時其有不錯的除臭功能[11]，故有些菌很可能沒有水解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，也就是缺乏色氨酸酶導致有除臭功能。</p><p><b>　　D．芽孢桿菌的應用</b></p><p>　　芽孢桿菌可制成適宜菌劑摻入飼料作為飼料添加劑[12]喂養(yǎng)家禽[13]

22、家畜[6]。</p><p>　　芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中，可提高畜禽生產(chǎn)性能，防治畜禽疾病[14]，凈化養(yǎng)殖環(huán)境。它們可調節(jié)消化道微生態(tài)平衡，提高畜禽消化能力，提高畜禽免疫力，產(chǎn)生營養(yǎng)素[15]。</p><p>　　蠟樣芽孢桿菌微生態(tài)制劑已在養(yǎng)殖業(yè)上得到應用[16]。蠟樣芽孢桿菌以孢子狀態(tài)進入動物消化道后, 生長繁殖、支持厭氧菌的生長繁殖, 保持腸內微生物與動物之間處于微生態(tài)平衡狀態(tài), 同時

23、參與腸道內的物質代謝, 從而達到抗菌、促進生長、提高飼料利用率的作用[17]。</p><p>　　動物的正常新陳代謝過程中，淀粉、脂肪、蛋白質等在體內不能完全的利用，而或多或少有一部分隨著糞便進入腸道，不免造成資源的浪費，而且這些有機物在體外的環(huán)境下很容易腐敗變質，發(fā)臭造成環(huán)境的污染與破壞。芽孢桿菌如果能對其進行利用，則即能節(jié)約資源又可保護凈化環(huán)境。不少動物體內都缺乏纖維素酶，所以食入體內的植物中的豐富的纖維素

24、都隨著糞便排出，纖維素是植物材料的主要成分，是地球極為豐富的可再生資源。纖維素的結構復雜，自然界中在纖維素酶的作用下纖維素可徹底水解成葡萄糖。充分利用這些纖維素又是課題的一個基本內容[18]。且芽孢桿菌產(chǎn)生的過氧化氫酶可以分解腸道內的過氧化氫生成游離氧，對腸道內的多種病原菌有殺滅作用，如果芽孢桿菌不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，可有效降低血液及糞便中吲哚的濃度，起到凈化環(huán)境的作用[19]。</p><p>　　

25、而幼仔動物腸道中消化酶的分泌不足消化能力差，而且腸道內的大腸桿菌等腐敗菌增多，會產(chǎn)生一些有害物質如吲哚、氨和硫化氫等，這些物質有潛在抑制生長和致癌的作用。需氧的芽孢桿菌在腸道中主要通過生物奪氧維持腸道生態(tài)平衡，它在腸道中短時間定植后，可以消耗大量氧氣，維持腸道的厭氧環(huán)境，為消化道中的乳桿菌、腸球菌和乳球菌等兼性厭氧菌及擬桿菌等厭氧菌提供更為理想的生長環(huán)境，增強腸道對厭氧菌的定植能力[20][21]。</p><p&g

26、t;　　E．本論文的研究目標</p><p>　　本論文通過從從自然界即包括雜質與芽孢桿菌的混合樣品中專一地分離出芽孢桿菌。通過一系列的產(chǎn)酶實驗及酶活性測定實驗來考察其對生物大分子分解代謝的能力和探索其在環(huán)境凈化過程中的作用機制，從而使該菌株產(chǎn)生實際意義。</p><p><b>　　1.材料和方法</b></p><p><b>　

27、　1.1 材料</b></p><p>　　1.1.1 樣品來源</p><p>　　本實驗的樣品有兩個，從舟山豬舍飼養(yǎng)槽得到的混合樣品編為1號樣品，從寧大舊體育場周圍提取的泥土樣品編號為2號樣品。</p><p><b>　　1.1.2 原料</b></p><p>　　1.1.3 儀器設備</p&g

28、t;<p>　　1.1.4 主要培養(yǎng)基及試劑配制</p><p>　?。?）LB液體培養(yǎng)基：0.5%酵母抽提物，1%蛋白胨，1%Nacl，pH7.6~7.8，121℃高壓蒸汽滅菌20min。</p><p>　　（2）LB固體培養(yǎng)基：0.5%酵母抽提物，1%蛋白胨，1%Nacl，1.5%瓊脂粉，pH7.6~7.8，121℃高壓蒸汽滅菌20min。</p><

29、;p>　?。?）生孢培養(yǎng)基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%MgSO4.7H20，0.02%（NH4）2SO4，</p><p>　　0.1%K2HPO4.3H20，1.5%瓊脂，pH7.6~7.8，121℃高壓蒸汽滅菌20min。</p><p>　　（4）石蕊牛奶培養(yǎng)基：1%脫脂牛奶，0.0075%石蕊，pH6.8，121℃滅菌15min。</p

30、><p>　?。?）蛋白胨水培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5% NaCl，pH調為7.6，121℃滅菌20min。</p><p>　?。?）中性紅水溶液：0.04g中性紅，28ml 95%乙醇，72ml蒸餾水。</p><p>　?。?）油脂培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%牛肉膏，0.5%NaCl，1%花生油，0.1%中性紅水溶液，1.5%瓊脂粉，pH7.2，121℃滅菌20m

31、in。</p><p>　　（8）淀粉培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%牛肉膏，0.2%可溶性淀粉，1.5%瓊脂粉，pH7.2，121℃滅菌20min。</p><p>　?。?）盧戈氏碘液：1g碘片，2g碘化鉀，300ml蒸餾水，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，混勻，定容。</p><p>　　（10）葡萄糖標準液：葡萄糖在恒溫干

32、燥箱中105℃下干燥至恒重，準確稱取100mg于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至100mL，充分混勻。4℃冰箱中保存。</p><p>　?。?1）DNS溶液：準確稱取DNS6.3g于500mL大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結晶苯酚和5g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后移入

33、1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL，充分混勻。貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。</p><p>　?。?2）檸檬酸緩沖液A液（0.1mol/L檸檬酸溶液）：準確稱取檸檬酸21.014g 于500mL大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL，充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　?。?3）檸檬酸緩沖液B液（0.1mol/L檸檬

34、酸鈉溶液）：準確稱取檸檬酸鈉29.412g于500mL 大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中，然后用蒸餾水定容至1000mL，充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　?。?4）檸檬酸緩沖液：取上述檸檬酸緩沖液A 液27.12mL，檸檬酸緩沖液B 液22.88mL，充分混勻后移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至100mL，充分混勻，即為0.05mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液。4℃冰箱

35、中保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　?。?5）福林試劑(Folin試劑)：于2000mL磨口回流裝置內，加入鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸鋰50g，蒸餾水50mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸15min，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000mL，用細

36、菌漏斗(No4～5)過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。</p><p>　?。?6）0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉42.4g，定容至1000mL。</p><p>　　（17）0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液：稱取三氯乙酸65.4g，定容至1000mL。 </p><p>　?。?8）pH7.2磷酸鹽緩沖液

37、：稱取磷酸二氫鈉31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液。 </p><p>　?。?9）2%酪蛋白溶液：準確稱取干酪素2g，稱準至0.002g,加入0.1N氫氧化鈉10mL，在水浴中加熱使溶解(必要時用小火加熱煮沸)，

38、然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL即成。配制后應及時使用或放入冰箱內保存，否則極易繁殖細菌，引起變質。</p><p>　?。?0）100μg/mL酪氨酸溶液：精確稱取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL1N鹽酸使溶解，用0.2N鹽酸定容至100mL，其濃度為1000μg/mL，再吸取此液10mL,以0.2N鹽酸定容至100mL，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后

39、也應及時使用或放入冰箱內保存,以免繁殖細菌而變質。</p><p>　?。?1）無菌生理鹽水：0.9%NaCl，121℃滅菌20min。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 菌株分離純化和保存</p><p><b>　　A．制備菌懸液</b></

40、p><p>　　分別從1號樣品和2號樣品中取出5g固體物質，無菌室研磨均勻后迅速倒入帶玻璃珠的45ml無菌生理鹽水錐形瓶中，震蕩5min使菌劑充分擴散，100℃下恒溫處理10min[22][23]，冷卻靜置，得到菌懸液1號樣與菌懸液2號樣。</p><p><b>　　B．涂布</b></p><p>　　無菌條件下分別在菌懸液1號樣與2號樣中取上

41、清液100uL，然后在LB固體培養(yǎng)基涂布均勻。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出長勢良好的單菌落。</p><p><b>　　C．劃線純化</b></p><p>　　無菌條件下分別將從涂布培養(yǎng)基上得到單菌落菌株在另一LB固體培養(yǎng)基上劃線，在37℃情況培養(yǎng)24小時，得到劃線平板。</p><p><b>　　D．保藏</b>

42、;</p><p>　　無菌條件下在上述劃線平板中分別挑取單菌落，每一菌株分別接種到兩個LB固體培養(yǎng)基斜面上，對應編號，37℃培養(yǎng)24小時后放置于冰箱內4℃保存。</p><p>　　1.2.2 菌株最適生長溫度與pH測定</p><p>　　A．最適生長溫度測定</p><p>　　將上述分離到的菌株分別接種于正常pH值的LB液體培養(yǎng)基中，

43、每個菌株做三個平行，分別在27℃、32℃、37℃、42℃、47℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，用72型分光光度計測量其OD值。</p><p>　　B．最適生長pH測定</p><p>　　將上述分離到的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基（pH分別為6、6.5、7、7.5、8，其他條件正常）中，每個菌株做三個平行，分別在其最適溫度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，用72型分光光度計測量其OD值。&l

44、t;/p><p>　　1.2.3菌株鑒定[24]</p><p>　　將上述分離到的菌株分別在生孢培養(yǎng)基（最適溫度與pH值條件下）中培養(yǎng)48h后，進行芽孢染色。染好色后用100倍油鏡觀察。如菌絲為桿狀或短桿狀并出現(xiàn)有綠色的芽孢或觀察有伴孢晶體的存在則證明其為芽孢桿菌；如無，則證明其不是。</p><p>　　1.2.4 試驗菌的代謝特性初步實驗[25][26][27]：

45、</p><p><b>　　A．酪素分解實驗</b></p><p>　　分別在菌株保存斜面LB固體培養(yǎng)基中加入等量無菌生理鹽水制備成菌體懸液，破碎5min后5000r/min離心10min，取等體積上清液分別接種于固定體積的石蕊牛奶培養(yǎng)基，每株菌分別做5個平行，在最適生長溫度下培養(yǎng)48h后觀察，如培養(yǎng)基變澄清則說明為陽性反應，該菌株可以分解酪素；反之，則說明為陰性

46、反應，該菌株不能分解酪素。</p><p><b>　　B．色氨酸分解實驗</b></p><p>　　分別在菌株保存斜面LB固體培養(yǎng)基中加入等量無菌生理鹽水制備成菌體懸液，破碎5min后5000r/min離心10min，取等體積上清液分別接種于固定體積的蛋白胨水培養(yǎng)基中，每株菌分別做5個平行，在最適生長溫度與pH條件下培養(yǎng)48h后，在此培養(yǎng)基中加入3-4滴乙醚，數(shù)次

47、，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑后觀察。如果在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物，則說明為陽性反應，該菌株可以分解色氨酸；反之，則說明為陰性反應，該菌株不能分解色氨酸。</p><p><b>　　C．油脂分解實驗</b></p><p>　　分別取分離到的菌點種于油脂培養(yǎng)基中，每株菌分別做5個平行，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)24h后觀察菌苔顏色。

48、如果出現(xiàn)紅色斑點，則說明為陽性反應，該株菌可以分解油脂；反之，則說明為陰性反應，該菌株不能分解油脂。</p><p>　　D．過氧化氫分解實驗</p><p>　　取干凈的載玻片，在上面滴l滴3％～5％的過氧化氫溶液，然后挑取l環(huán)培養(yǎng)18-24h的待測菌株，每株菌分別做5個平行，在過氧化氫溶液中涂抹后觀察。如果有氣泡(氧氣)出現(xiàn)，則說明為陽性反應，該菌株可以分解過氧化氫；反之，則說明為陰性

49、反應，該菌株不能分解過氧化氫。</p><p>　　E．淀粉分解實驗[28]</p><p>　　將滅菌后的淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，倒成平板，凝固后，取待測菌株18-24h的純培養(yǎng)物點于平板上，每皿可點種3-5個菌株，適溫培養(yǎng)2-4d形成菌落后，在平板上滴加盧戈氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板成藍色，再觀察。如果菌落周圍有無色透明圈出現(xiàn)，則說明為陽性反應，該菌株可以分解淀粉；反之則說明

50、為陰性反應，該菌株不能分解淀粉。透明圈的大小說明分解淀粉能力的大小。</p><p>　　1.2.5試驗菌的纖維素蛋白質分解能力測定</p><p>　　A．纖維素分解實驗[29]</p><p>　　a.葡萄糖標準曲線測定</p><p>　　取8支洗凈烘干的20mL具塞刻度試管，編號后按表1加入標準葡萄糖（G）溶液和蒸餾水，配制成一系列不

51、同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5mLDNS溶液，搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20mL，充分混勻。在540nm波長下，以1號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以對應的光密度值為縱坐標，在坐標紙上繪制出葡萄糖標準曲線。</p><p>　　表1 葡萄糖標準曲線制作</p><p>　　b．濾紙

52、酶活力的測定</p><p>　　每株分離到的菌株均接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在最適生長溫度與pH值條件下培養(yǎng)48h后得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)過超聲波破碎5min后5000r/min離心10min后取上清液得到粗酶液。</p><p>　　對每株菌分別采取以下方法測定：取3支洗凈烘干試管，編號后各加入0.5mL酶液和1.5mL 0.05 mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液，向1號試管中加

53、入1.5mLDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調零用。將3支試管同時在50℃水浴中預熱5～10min，再各加入濾紙條50mg（新華定量濾紙，約1cm×1cm），50℃水浴中保溫1h后取出立即向2、3號試管中各加入1.5mLDNS溶液以終止酶反應，充分搖勻后沸水浴5min-10min，取出冷卻后用蒸餾水定容至25mL，充分混勻。以1號試管溶液為空白對照調零點，在540nm波長下測定2、3號試管液的光密度值并記錄結果。&

54、lt;/p><p><b>　　c.計算</b></p><p>　　根據(jù)2個重復光密度的平均值，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，按下式計算出濾紙酶活力（U/g）。在上述條件下，每小時由底物生成1umol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。</p><p>　　濾紙酶活力（U/g）= 葡萄糖含量（mg）×酶液定容總體積(m

55、L)×5.56 </p><p>　　反應液中酶液加入量（mL）×樣品重（g）×時間（h）式中：5.56為1mg葡萄糖的umol數(shù)。（1000/180=5.56）</p><p>　　B．蛋白質分解能力實驗[30]</p><p>　　a.酪氨酸標準曲線測定</p><p>　　測定步驟:取6支試

56、管分別編號，按表2分別吸取不同濃度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸鈉5mL,再各加入已稀釋的福林試劑1mL。搖勻置于水浴鍋中。40℃保溫發(fā)色20min，分別用72型分光光度計測定光密度(OD) (波長660nm)。測三次,取平均值。將1～6號管所測得的光密度(OD)減去1號管(蒸餾水空白試驗)所測得的光密度為凈OD數(shù)。以凈OD值為橫坐標,酪氨酸的濃度為縱坐標,繪制成標準曲線(或可求出每度OD所相當?shù)睦野彼崃縆)。</p>

57、<p>　　表2酪氨酸標準曲線制作</p><p><b>　　b.樣品測定: </b></p><p>　　每株分離到的菌株均接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在最適生長溫度與pH值條件下培養(yǎng)48h后得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)過超聲波破碎5min后5000r/min離心10min后取上清液得到粗酶液。</p><p>　　取15

58、5;100mm試管3支,編號1、2、3,每管內加入粗酶液或稀釋的粗酶液1mL,置于40℃水浴中預熱2min,再各加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白1mL,精確保證10min,時間到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以終止反應,繼續(xù)置于水浴中保溫20min,使殘余蛋白質沉淀后離心或過濾,然后另取15×150mm試管3支,編號1、2、3,每管內加入濾液1mL,再加0.4mol碳酸鈉5mL,已稀釋的福林試劑1mL,搖勻,40℃保溫發(fā)色

59、20min后進行光密度(OD)測定。 </p><p>　　空白試驗也取試管3支,編號(1)、(2)、(3),測定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。</p><p>　　樣品的平均光密度(OD)一空白的平均光密度(OD)=凈OD值。</p><p><b>　　c.計算：</b></p>

60、;<p>　　在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位。</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位(干基)=A/10×4×N </p><p>　　式中:A——由樣品測得OD值,查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；</p><p>　　4——4毫升反應液取出1 mL測定 (即4倍)；

61、</p><p>　　N——酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10——反應10min；</p><p><b>　　2. 結果與分析</b></p><p><b>　　2.1 菌株篩選</b></p><p>　　2個實驗樣品分別制備樣品懸液并加熱煮沸10min處理后，

62、對應涂布于LB固體培養(yǎng)基中正常條件培養(yǎng)，總共得到了三株菌：從1號樣品里得到的一株菌，編號為Y1；其他兩株為2號樣品里得到的菌株，分別編號為Z1、Z2。</p><p>　　樣品懸液沒有經(jīng)過梯度稀釋而直接如上處理后涂布，最后卻僅僅只分離到三株菌，這是因為篩選方法的特殊。因為芽孢是高度耐熱的抗逆性休眠體，本身就在100℃中10min內不受很大影響，而一般營養(yǎng)型菌體因正常生命活動被破壞而被同時殺死，從而篩選掉了大部分的

63、雜菌。這是本篩選方法的最主要優(yōu)點——選擇性非常高。當然也不排除有嗜熱菌的存在，這需在后續(xù)的鑒定實驗中進行補充驗證。</p><p>　　2.2 最適生長溫度與pH探索</p><p>　　2.2.1 最適生長溫度測定</p><p>　　將上述得到的三株菌Y1、Z1、Z2分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，每個菌株做三個平行，分別使其在27℃、32℃、37℃、42℃、47℃

64、恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其他條件不變，培養(yǎng)24h后取出后用72型分光光度計測量其OD值。結果如圖1所示。</p><p>　　由圖1所示，三株菌Y1、Z1、Z2的最適生長溫度分別為32℃、32℃和37℃。其生長情況基本都符合拋物線形式，分別在最適溫度達到最大OD值，實驗結果準確性相對較高。</p><p>　　Z1菌株對溫度相對比較敏感，最適溫度與相鄰選擇溫度之間測定的OD值差額明顯，對溫度的恒

65、定要求較高。而Y1和Z2菌株則表現(xiàn)的不是那么明顯，可以適應較廣泛的溫度培養(yǎng)條件。</p><p>　　相比較來說三株菌在分別在其最適生長溫度情況下培養(yǎng)，Z1號菌生長情況最優(yōu)，Z2號菌次之，Y1號菌生長情況最差。</p><p>　　圖1三株菌最適生長溫度探索</p><p>　　2.2.2 最適生長pH測定</p><p>　　將上述得到三株

66、菌Y1、Z1、Z2分別接種于LB液體培養(yǎng)基（pH分別為6、6.5、7、7.5、8，其他正常）中，每個菌株做三個平行，分別在其最適生長溫度下恒溫培養(yǎng)24h后取出后用72型分光光度計測量其OD值。</p><p><b>　　結果如圖2所示。</b></p><p>　　由圖2可得，三株菌Y1、Z1、Z2的最適生長pH值分別為7、7、7.5。其生長情況基本都符合拋物線形式

67、，分別在最適pH值達到最大OD值，實驗結果準確性相對較高。</p><p>　　Z2株對pH值相對比較敏感，最適pH值與相鄰選擇pH值之間測定的OD值差額明顯，對pH值恒定要求較高。而Y1和Z1菌株則表現(xiàn)的不是那么明顯，可以適應較廣泛的pH值培養(yǎng)條件。尤其明顯的是Y1菌株在pH6.5-7.5范圍內OD值相差無幾，Z1菌株在pH值6.5與7時測量OD值幾近相同。</p><p>　　相比較來

68、說三株菌在分別在其最適PH情況下培養(yǎng)，Z2號菌生長情況最優(yōu)，Z1號菌次之，Y1號菌生長情況最差。</p><p>　　圖2三株菌的最適pH值探索</p><p><b>　　2.3 菌株的鑒定</b></p><p>　　以上得到的三株菌Y1、Z1、Z2分別在液體生孢培養(yǎng)基中最適條件下培養(yǎng)48h后，經(jīng)過芽胞染色及100倍油鏡顯微觀察，多個觀察點

69、得出一致結論，Y1、Z1、Z2三株菌的單個菌體均呈小的桿狀，在菌體中間有觀察到綠色的芽孢存在，故判定三株菌Y1、Z1、Z2均為芽孢桿菌。</p><p>　　2.4 試驗菌的代謝特性初步實驗</p><p>　　2.4.1 酪素分解實驗</p><p>　　分別在三個菌株保存斜面LB固體培養(yǎng)基中加入等量無菌生理鹽水制備成菌體懸液，破碎5min后5000r/min離心

70、10min，取等體積上清液分別接種于固定體積的石蕊牛奶培養(yǎng)基，每株菌分別做5個平行，在最適生長溫度下培養(yǎng)48h后觀察原來渾濁的石蕊牛奶培養(yǎng)基變化情況，結果如表3所示。</p><p>　　由表3可知，Y1號菌不能分解酪素，Z1號菌可分解酪素，而Z2號菌因其結果相差不大而不能確定是不是對酪素有分解能力，故為空白。</p><p>　　這個實驗只是為了為后面定性實驗做個小小的鋪墊，大致了解一下

71、其產(chǎn)蛋白酶的情況。故而對Z2號菌實驗結果的不理想情況沒有進行再度的重復實驗。</p><p>　　2.4.2 色氨酸分解實驗</p><p>　　分別在三個菌株保存斜面LB固體培養(yǎng)基中加入等量無菌生理鹽水制備成菌體懸液，破碎5min后5000r/min離心10min，取等體積上清液分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，分別做5個平行，在最適生長溫度與pH條件下培養(yǎng)48h后分別對培養(yǎng)液進行處理，觀察乙

72、醚與培養(yǎng)物間紅色產(chǎn)生情況，結果如表3所示。</p><p>　　由表3可知，三株菌均表現(xiàn)出了一致的實驗結果，反應均為陰性反應，可證明三株菌均不可以分解色氨酸，即不能因之產(chǎn)生出吲哚，而糞便的主要臭味主要就是吲哚及其衍生物的濃度太大導致的，這也說明此三株菌均有除臭的作用。</p><p>　　2.4.3 油脂分解實驗</p><p>　　分別取三株菌點種于油脂培養(yǎng)基中，

73、每個菌株分別做5個平行，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)24h后，觀察菌苔顏色，結果如表3所示。</p><p>　　由表3所知，三株菌均表現(xiàn)出了一致的實驗結果，反應均為陽性反應，即可證明三株菌均可以分解油脂，對油脂均有代謝分解能力。</p><p>　　2.4.4 過氧化氫分解實驗</p><p>　　取干凈的載玻片，在上面滴l滴3％～5％的過氧化氫溶液，分別挑取l環(huán)培養(yǎng)

74、24h的待測菌株在載玻片上的過氧化氫溶液中涂抹，每個菌株分別做5個平行，同時取體積相似的除菌泥清潔泥土同樣涂抹作為空白，觀察結果如表3所示</p><p>　　空白結果為陰性反應，表3所知，三株菌的5個平行均表現(xiàn)出了一致的實驗結果，反應均為陽性反應，可證明三株菌均可以分解過氧化氫，對過氧化氫有代謝分解能力。</p><p>　　表3 三株菌酪素、色氨酸、油脂、過氧化氫分解實驗結果</

75、p><p>　　注：以上所得結果分別來自于5個平行數(shù)據(jù)，+代表為陽性反應，-代表為陰性反應，空白為不能確定 </p><p>　　2.4.5 淀粉分解實驗</p><p>　　將滅菌后的淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，倒成平板，凝固后，分別取三株待測菌株培養(yǎng)24 h的純培養(yǎng)物點于平板上，每皿可點種5個菌株，在最適溫度下培養(yǎng)48h形成菌落后，分別在平板上滴加盧戈氏碘液，以鋪滿

76、菌落周圍為度，平板成藍色，再觀察。實驗結果如表4所示。</p><p>　　表4 三株菌淀粉分解實驗結果</p><p>　　注：以上所得結果分別來自于5個平行數(shù)據(jù)，+代表為陽性反應，-代表為陰性反應。</p><p>　　由表4所示，三株菌均表現(xiàn)為陽性反應，即均可以產(chǎn)生透明圈，以上三株菌其透明圈直徑與菌落直徑比值分別為1.823，1.168，1.826，相比來說三

77、株菌其比值相差不大，Y1菌株與Z2菌株直徑比值基本相同，Z1菌株相對小一些。但三株菌比值均未超過2，實際說明其分解淀粉能力不是很強。究其原因，可能是菌本身分解淀粉能力就差一些，還可能是因為一些培養(yǎng)過程中的條件沒設置好。仍需經(jīng)過將這些因素優(yōu)化后再進行進一步研究與探索。</p><p>　　2.5 試驗菌的纖維素蛋白質分解能力測定</p><p>　　2.5.1 纖維素分解實驗</p&g

78、t;<p>　　A．葡萄糖標準曲線的繪制</p><p>　　不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5mLDNS溶液，搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20mL，充分混勻。在540nm波長下，以1號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以對應的光密度值為縱坐標，在坐標紙上繪制出葡萄糖標準曲線。如圖3所示。</

79、p><p><b>　　B．纖維素酶活測定</b></p><p>　　Y1、Z1、Z2菌株均接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在最適生長溫度與pH值條件下培養(yǎng)48h后得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)過超聲波破碎5min后5000r/min離心10min后取上清液得到粗酶液。</p><p>　　對每株菌分別采取以下方法測定：取3支洗凈烘干試管，編號后各加入0.

80、5mL粗酶液和1.5mL0.05mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液，向1號試管中加入1.5mLDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調零用。將3支試管同時在50℃水浴中預熱10min，再各加入濾紙條50mg（新華定量濾紙，約1cm×1cm），50℃水浴中保溫1h后取出立即向2、3號試管中各加入1.5mLDNS溶液以終止酶反應，充分搖勻后沸水浴10min，取出冷卻后用蒸餾水定容至25mL，充分混勻。以1 號試管溶液為空白對

81、照調零點，在540nm波長下測定2、3號試管液的光密度值并記錄結果。結果如表5所示。</p><p>　　圖3 葡萄糖標準曲線</p><p>　　表5 三株菌纖維素酶活測定結果</p><p>　　注：以上所得結果均來自于2個平行數(shù)據(jù)</p><p>　　由表5所示，Y1與Z2菌株都有一定的纖維素酶活性，Y1活性最高，Z2活性次之。而Z2菌

82、株其吸光值僅為0.01，而酶活測定結果為54.76U/g，比其他菌株數(shù)值少了三個數(shù)量級，基本確定其無纖維素酶活性。2.5.2 酪蛋白分解實驗</p><p>　　A. 酪蛋白標準曲線測定</p><p>　　不同濃度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸鈉5mL,再各加入已稀釋的福林試劑1mL。搖勻置于水浴鍋中。40℃保溫發(fā)色20min用72型分光光度計進行測定(波長660nm)。一般測三

83、次,取平均值。將1～6號管所測得的光密度(OD)減去1號管(蒸餾水空白試驗)所測得的光密度為凈OD數(shù)。結果如圖4所示。</p><p><b>　　B．酪蛋白酶活測定</b></p><p>　　每株分離到的菌株均接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在最適生長溫度與pH值條件下培養(yǎng)48h后得到培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)過超聲波破碎5min后5000r/min離心10min后取上清液

84、得到粗酶液。</p><p>　　取15×100mm試管3支,編號1、2、3,每管內加入粗酶液或稀釋的粗酶液1mL,置于40℃水浴中預熱2min,再各加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白1mL,精確保證10min, 時間到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以終止反應,繼續(xù)置于水浴中保溫20min,使殘余蛋白質沉淀后離心或過濾,然后另取15×150mm試管3支,編號1、2、3,每管內加入濾液1mL,

85、再加0.4mol碳酸鈉5mL,已稀釋的福林試劑1mL,搖勻,40℃保溫發(fā)色20min后進行光密度(OD)測定。空白試驗也取試管3支,編號(1)、(2)、(3),測定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。結果如表6所示。</p><p>　　圖4 酪蛋白標準曲線</p><p>　　表6 三株菌酪蛋白酶活測定結果</p><p&

86、gt;　　注：以上所得結果均來自于3個平行數(shù)據(jù)</p><p>　　由表6可知，Z1、Z2菌株均有酪蛋白酶活性，Z1菌株活性大于Z2菌株，而Y1菌株所測OD值約為0，故判定其沒有分解酪蛋白的能力。相對三株菌來說，三株菌所測最后酶活性相差不大，尤其是已經(jīng)被判斷為無分解酪蛋白能力的Y1菌株與有酪蛋白酶活性的Z2菌株相比，結果相差不大。所以判斷Z2菌株酶活性也不是甚高。三株菌酪蛋白酶活性均不是很高，當然還是Z1菌為優(yōu)。

87、</p><p><b>　　3．討論</b></p><p>　　本實驗從自然界樣品中分離得到三株芽孢桿菌分別編號Y1、Z1、Z2，采用的是加熱煮沸樣品液10min后再進行涂布分離，這也是分離芽孢桿菌最簡單也是最有效的實驗方法。究其最大優(yōu)點即其篩選程度非常之高，自然界中的菌多種多樣，但如此處理，就僅僅分離出三株芽孢桿菌。當然，自然界中芽孢桿菌種類也是繁多的，如此處理

88、后菌種類如果太多，則有必要進行二級篩選，即實驗用的LB培養(yǎng)基可用纖維素培養(yǎng)基（糖類物質僅包含有纖維素）代替，如果不能分解纖維素則其不能在其上生長，能夠更有效的有方向的分離。</p><p>　　對菌株的鑒定僅做了芽孢染色，因其具有芽孢，芽孢染色如果成功的話，對實驗本身已經(jīng)有很大說服力了?？陀^因素是沒有條件進行16SRNA序列比對，如果有條件的話可以進行此鑒定，更有說服力。</p><p>

89、　　對生長最適溫度與最適pH值的探索僅僅是作為一個小小的參考，主要目的即是在比較優(yōu)勢的條件下，對三株菌進行培養(yǎng)，使更好的生長及生產(chǎn)出更多的酶供后緒實驗用。但仍有不足，本實驗進行的僅僅是對生長條件的探索，而不是對產(chǎn)酶條件的探索，最好的結果應該是做出不同溫度,pH，裝液量，搖床轉速等等諸多因素綜合條件下對某特定各類的酶的酶活的影響，而且還必須作正交試驗，才能保證最優(yōu)最準確。</p><p>　　對芽孢桿菌分解代謝能力

90、的定性實驗做了酪素、色氨酸、油脂、過氧化氫和淀粉的探索，分別做了五個平行，其結果一般呈極端分布，比較具有說服力。Z2菌的酪素分解能力探索結果區(qū)分度不明顯，但后緒酪蛋白酶活可證明問題，故沒有再做進一步的補充實驗。通過對酪素、油脂和淀粉的實驗可以了解菌株分解有機物的能力；通過對色氨酸的實驗，可以了解菌株能否使其分解產(chǎn)生吲哚從而產(chǎn)生臭味；通過對過氧化氫的實驗，可以了解菌株動物腸道分解過氧化氫能力，即制造特殊腸道環(huán)境的能力。</p>

91、<p>　　對芽孢桿菌分解代謝能力的定量實驗做了纖維素、蛋白質的探索，其中最有意義的是纖維素的探索，因為植物細胞中有大量纖維素，很多動物以植物為食，但因體內缺少纖維素酶而不能充分利用，從而大量的浪費了自然界中的能量。如果菌可以分解纖維素，那么其就可以在動物腸道里幫助分解有機物，使更好的更充分的利用資源產(chǎn)生效益。而對蛋白質的探索也仍然很重要，動物體內攝入的主要成分很多都包括此物質，能否分解利用對養(yǎng)殖業(yè)有很大的影響。</

92、p><p>　　該實驗所得到的三株菌其所能產(chǎn)出的酶是有差別的，Y1菌株不能產(chǎn)生蛋白酶，Z1菌株不能產(chǎn)生纖維素酶，單一菌株不能完全的滿足養(yǎng)殖業(yè)需求，可以對三株菌進行一定比例的混調再進行酶活性的分析，得到最優(yōu)比例及最大的養(yǎng)殖業(yè)效益。同時可以不局限于芽孢桿菌屬，跟其他菌比如光合細菌等聯(lián)合進行實驗。</p><p>　　其他還可以做一下比如有機溶劑等對酶活性的影響，更豐富完善[32][33]。<

93、/p><p><b>　　4．結論</b></p><p>　　本實驗經(jīng)過篩選和鑒定得到了三株芽孢桿菌，分別為Y1、Z1、Z2。三株芽孢桿菌的最適生長溫度分別為32℃、32℃、37℃，最適生長pH值分別為7、7、7.5。三株菌均可分解油脂與過氧化氫，而對色氨酸則沒有分解能力，淀粉透明圈比值分別為1.823，1.168，1.826。Y1、Z2菌株纖維素酶活力分別為21034

94、U/g與17370U/g，Z1菌株無分解纖維素能力；Z1、Z2菌株酪蛋白酶活力分別為11.15U/g與3.92U/g，Y1菌株無分解酪蛋白能力。</p><p><b>　　5. 建議</b></p><p>　　從結果可知，Y1、Z1、Z2菌均可以分解油脂與過氧化氫，對淀粉也均有一定代謝能力，而且不能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚而防臭。但Z1菌株不能分解纖維素，Y1菌株不能分

95、解酪蛋白，而且Z2菌株的纖維素酶活力不如Y1菌株；酪蛋白酶活力不如Z1菌株，找到三者中的比例平衡能更好的更充分的利用現(xiàn)有的營養(yǎng)條件來飼養(yǎng)家畜。同時，也不僅僅局限于芽孢桿菌菌屬，可以與光合細菌及其他屬細菌聯(lián)合研究。此實驗為后緒實驗做了一定的準備與鋪墊。對后緒實驗起了一定的引導作用。綜合研究結果，建議以后實驗對Y1、Z1、 Z2菌株均做更進一步的研究或有更大的廢物發(fā)酵轉化的應用潛力。</p><p><b>

96、;　　參考文獻</b></p><p>　　[1]Claus D,Berldey R C W. Bergey’s Manual of Systermatics Bacteriology[M]. 1986:1105-1140.</p><p>　　[2]韓延平,楊瑞馥. 需氧芽孢桿菌分類學研究進展[J]. 微生物免疫學進展,2001,29(4):73-78.</p>

97、<p>　　[3]王津紅,吳衛(wèi)輝,陳月華,等. 中國蘇云金芽孢桿菌的分布與cry基因的多樣性[J]. 微生物學通報,2001,28(3):50-55.</p><p>　　[4]龔國淑,唐志燕,楊成偉,等. 成都郊區(qū)土壤芽孢桿菌的生防潛力[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學學報,2009,27(3):333-337.</p><p>　　[5]徐楊,王楠,李偉,等. 海洋枯草芽孢桿菌3512

98、A抗真菌脂肽的分離純化及結構特性鑒定[J]. 中國生物防治,2009,25(4):</p><p><b>　　328-333.</b></p><p>　　[6]肖鳳平. 枯草芽孢桿菌在生豬養(yǎng)殖中的應用[J]. 今日畜牧獸醫(yī),2010,11(3):24.</p><p>　　[7]劉桂君,朱婷婷,劉紅霞,等. 清香大曲及酒醅中地衣芽孢桿菌的分

99、離鑒定[J]. 釀酒科技,2010,15(1):31-36.</p><p>　　[8]柏建玲,莫樹平,鄭婉玲,等. 地衣芽孢桿菌與其他微生物產(chǎn)酶能力的比較[J]. 飼料研究,2003,13(7):4-6.</p><p>　　[9]吳敏峰,耿秀蓉,祝小,等. 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定[J]. 飼料工業(yè),2006,27(20):21-24.</p><p>　　

100、[10]黃鷺強,謝必峰,黃建忠,等. 芽孢桿菌WF63脂肪酶分離純化及酶學性質[J]. 云南民族大學學報：自然科學版,2010,19(4):</p><p><b>　　290-293.</b></p><p>　　[11]李彪,熊焰. 豬糞中除臭微生物的篩選和鑒定[J]. 家畜生態(tài)學報,2008,29(1):74-76.</p><p>　　

101、[12]高傳慶,潘康成,張鈞利. 國外飼用芽孢桿菌的研究和應用[J]. 北方牧業(yè),2010,9(18):11.</p><p>　　[13]宋峻峰,李彪,王紹輝. 福邦枯草芽孢桿菌在商品肉鴨養(yǎng)殖中的應用[J]. 中國牧業(yè)通訊,2010,18(9):34-35.</p><p>　　[14]Herstad H.K, Nesheim B.B，Lund T.L，et al．Efects of a

102、 probiotic intervention in acute caninegastroenteritis．a(chǎn) controlled clinical trial [J]．Journal of Small Animal Practice,2009,51(1):34-38．</p><p>　　[15]翟繼鵬,張金枝. 枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中的應用研究進展[J]. 浙江畜牧獸醫(yī),2010,35(3):7-8.&l

103、t;/p><p>　　[16]李野,張小平,張克強,等. 蠟質芽孢桿菌DLSL-2 發(fā)酵條件探討及培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 微生物學通報,2005,21(2):45-49.</p><p>　　[17]劉瑩,孫榮丹，楊翔華,等. 5株芽孢桿菌的分離鑒定、拮抗性試驗與抑菌效價測定[J]. 中國農(nóng)學通報,2006,22(5):32-34.</p><p>　　[18]賀剛,何力,

104、謝從新,等. 草魚腸道一株產(chǎn)纖維素酶的分離純化及性質研究[J]. 水生態(tài)學雜志,2008,1(6):107-110.</p><p>　　[19]范俊娟. 3株蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)酶特性的檢測[J]. 畜牧與獸醫(yī),2009,21(9):73-75.</p><p>　　[20]郭興華. 益生菌一基礎應用[M]. 科學技術出版社,2002:14-279．</p><p>　

105、　[21]李松彪,秦翠麗,張許科等. 動物微生態(tài)制劑的生產(chǎn)及其應用[J]. 河南畜牧獸醫(yī),2001,22(10):13-14．</p><p>　　[22]王艷萍,陳瑩,趙虎山,等. 一株同型乳酸發(fā)酵芽孢桿菌的分離和鑒定[J]. 天津輕工業(yè)學院學報, 1996.31(1):1-5.</p><p>　　[23]鄒偉,趙玉軍，陳曉月,等. 土壤中芽孢桿菌的分離及初步鑒定[J]. 四川畜牧獸醫(yī)

106、,2008,35(2):24-25.</p><p>　　[24]Buchanan R.E,Gibbons N.E.伯杰細菌鑒定手冊,第8版[M]. 北京科學出版社,1984:729-758.</p><p>　　[25]周德慶. 微生物學實驗手冊[M]. 上?？茖W技術出版社,1986:79-163.</p><p>　　[26]宋大新,范長勝,徐德強,等. 微生物

107、實驗技術教程[M]. 上海復旦大學出版社,1993:206-262.</p><p>　　[27]沈萍,秀容,李廣武,等. 微生物學實驗,第3版[M]. 北京高等教育出版社,1999:69-89.</p><p>　　[28]陳曉明,張良,張建國,等. 枯草芽孢桿菌淀粉酶高產(chǎn)菌株的輻射誘變研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學報,2008.26(3):</p><p>

108、<b>　　177-182.</b></p><p>　　[29]孫軍德,陳南. 秸稈纖維素降解細菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2010.41(2):210-213.</p><p>　　[30]陳營,王福強,李緒全. 三株芽孢桿菌生長與蛋白酶活性的研究[J]. 淡水魚業(yè),2004,34(3)：19-21.</p><p&g

109、t;　　[32]Xua Jiaxing,Jiang Min,Sun Honglin,etc.An organic solvent-stable protease from organic solvent-tolerant Bacillus cereus WQ9-2: Purification, biochemical properties, and potential application.[J] Bioresource Techno

110、logy,2010,101(4):7991-7994.</p><p>　　[33]Kunal Shah,Kalpana Mody,Jitendra Keshri,etc. Purification and characterization of a solvent, detergent and oxidizing agent tolerant protease from Bacillus cereus isol