枯草芽孢桿菌分子分型及其對海水水質凈化效果的研究.pdf

1、枯草芽孢桿菌可將水體中有機物分解為小分子的有機酸、氨基酸等物質，因此，它是水產養(yǎng)殖系統(tǒng)中最有效的水質凈化菌種之一。本文首先建立了枯草芽孢桿菌的PCR快速鑒定方法，然后對海南島不同地理來源的多種海水水體開展了枯草芽孢桿菌的分離、純化和鑒定以及對各菌株進行了RAPD分型的工作，同時研究了不同遺傳型菌株的水質改良效果，具體結果如下： 1、以枯草芽孢桿菌的gyrB基因設計了2對特異性引物，分別為F1、F2。以標準的枯草芽孢桿菌做PCR檢

2、測，結果表明，F1和F2能獲得分子量分別為387bp和362bp的目的條帶。利用其它12株非枯草芽孢桿菌進行PCR特異性檢測，結果表明引物對F1和F2的特異性較強，從而首次成功建立了枯草芽孢桿菌的PCR快速鑒定方法。 2、本文首次以海南島多個地理來源的不同水體為菌種分離對象，結合傳統(tǒng)的生化鑒定手段，采用選擇性培養(yǎng)基和本文建立的PCR快速檢測方法共分離、純化和鑒定了45株枯草芽孢桿菌菌株，這些菌株的主要來源地為海口、文昌、萬寧、陵

3、水、樂東、東方、三亞，分別分離得到17株、1株、19株、3株、1株、4株和1株。 3、利用RAPD分子標記技術對46株(包括枯草芽孢桿菌標準株ctccAB90008)枯草芽孢桿菌進行了分子分型。為了提高RAPD技術穩(wěn)定性和可重復性，本文首先優(yōu)化了模板DNA濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度以及退火溫度和時間、延伸時間、循環(huán)次數等RAPD技術的主要影響因素，最終建立了適用于枯草芽孢桿菌的最佳RAP

4、D反應體系，即在25μl的總體系中，包括10×PCRbuffer2.5μl，Mg2+(25mmol/L)為2μL，dNTPs(2.5mmol/L)為2μL，引物(10μmol/L)為1μL，DNA聚合酶1.0U，DNA模板2.0μL；循環(huán)參數為：94℃預變性4min，94℃變性45s、38℃退火45s、72℃延伸1。5min，共40個循環(huán)，72℃延伸7min。通過對60條RAPD隨機引物的篩選，共獲得11條對該菌擴增效果穩(wěn)定、多態(tài)性豐富

5、的隨機引物，選用上述11條引物對46個菌株基因組DNA進行PCR擴增，結果表明，這46株枯草芽孢桿菌具有豐富的遺傳多樣性，共產生了1802條擴增條帶，這些條帶呈100％的多態(tài)性，即這些引物都能單獨使這46株菌株產生特異性的指紋圖譜，因此，本文為上述枯草芽孢桿菌菌株建立了一種極有效分子鑒定方法。根據UPGMA方法建立了所有菌株的系統(tǒng)進化樹，結果表明，在遺傳距離大約為0.53的位置，可以將46個菌株分成14個基因型，分別為A～O型、，其中大

6、多數的菌株集中在第K型和第L型，且絕大多數相同地理來源的菌株具有更近的親緣關系。 4、根據RAPD技術的分型結果，本文從14個遺傳型中分別隨機選取1株枯草芽孢桿菌進行水質改良效果研究，測定的水質因子有水體COD、氨氮和pH，結果表明，菌株WC07001和菌株WL07003的水質改良效果明顯，且菌株WC07001對氨氮的降解作用最佳，而菌株WL07003則對COD的降解作用最佳，這表明不同枯草芽孢桿菌菌株可能對水質作用效果不一，因