芽孢桿菌的生防菌株篩選及其抑病機理.pdf

1、本研究從感染根結線蟲的番茄根系中分離到46個細菌菌株，NA平板初篩獲得13個抑制青枯雷爾氏菌生長的拮抗菌株，其抑菌圈寬度達7.1～26.3 mm，同時測得其中12個菌株對多種植物病原真菌有不同程度的抑制作用。溫室試驗表明，菌株EN5、EN15、EN01和EN16對青枯病的抑病效果最為顯著，平均防效分別為70.82％、89.54％、85.38％和78.81％；而EN5、SW1和SB2能有效降低番茄根結線蟲病的根結指數(shù)，抑病效果均達49％。

2、同時測定了這些菌株對青枯病菌-根結線蟲復合病的防治效果，結果表明，EN5、SW1和SB2能顯著降低復合病害的病情指數(shù)，其中SW1的防效最佳，青枯病指數(shù)比對照下降56.66，根結指數(shù)降低5.21。自然土中重復測定EN5等7個菌株對青枯病和復合病害的抑病作用，其中菌株EN5、EN16、SW1和SB1的抑病效果較為穩(wěn)定。通過形態(tài)和生理生化特征初步鑒定，菌株EN5、EN15、EN01、SB1、SB2和SW1等6個菌株為枯草芽孢桿菌(Bacill

3、us subtilis)，而EN16為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)；16S rDNA序列分析進一步確定菌株EN5為枯草芽孢桿菌內(nèi)生亞種(V.subtilis subsp.endophvticus)。 對菌株EN5、EN16、SW1和SB1防治番茄青枯病的作用機理進行分析，結果表明，菌株EN5處理番茄后20d，在番茄根莖部有較高定殖量(達3.60×10<'4>cfu/g·FW)，該菌株胞外液無抗菌活性，其抑病效

4、果僅13.56％，菌體抑病效果則高達71.19％，因此推斷其作用機理是以菌體的定殖競爭作用為主；菌株SBl胞外液的抗菌活性相當顯著，其抑病效果達50.85％，而定殖力明顯弱于其他三個供試菌株，誘導試驗中防效較差，由此推測其抑病作用主要依賴于胞外液的抗菌活性；SW1和EN16胞外液的抑病效果分別為22.03％和27.12％，遠低于其菌體的抑病作用，同時兩菌株具有較好的定殖力，說明抑病作用與其菌體的定殖力有關，此外，誘導抗性試驗表明兩菌株能

5、有效地誘導番茄抗青枯病，誘發(fā)過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等抗病相關性酶活性的顯著增強，因此，誘導抗性是它們的主要抑病機制之一。 以電鏡觀察法進一步分析菌株EN5在番茄根莖組織中的分布，結果顯示，EN5主要分布于主根基部及莖部的韌皮組織、細胞間隙等部位。盆栽試驗分析EN5菌株在不同土壤條件、不同接種方式及不同作物中的定殖力，結果表明，菌株EN5在自然土和滅菌土條件下均能穩(wěn)定地定殖于番茄植株；

6、浸種、浸根和灌根處理條件下，以灌根法的定殖效果最佳；在番茄、煙草和黃瓜體內(nèi)均可定殖，其中在番茄和煙草體內(nèi)的定殖量較大。菌株EN5對番茄體內(nèi)及土壤中微生物種群影響的測定結果表明，EN5處理后，植株內(nèi)3類主要微生物種群數(shù)量明顯減少，而土壤中微生物種群在處理初期有所減少，處理后期則多數(shù)微生物群體，尤其是氨化細菌、固氮菌等生理微生物群體數(shù)量顯著增多，此外，ERIC-PCR結果也表明，EN5的處理還對根圍土中微生物的種類產(chǎn)生一定的影響。菌株EN1

7、6和SW1灌根處理后2～10 d內(nèi)挑戰(zhàn)接種青枯病菌，均能有效誘導番茄對青枯病的抗性，其中以間隔期為7～10d誘導效果最好，與此結果相符的是，POD、PPO和PAL的酶活力在7～10d時也達到較高值。以灌根和浸種法接種菌株EN16和SW1，灌根處理可有效誘導番茄產(chǎn)生抗病性，浸種處理誘導效果較差。盆試測定菌株SW1和EN16對煙草花葉病毒病的誘導效果，結果表明，菌株SW1的誘導效果優(yōu)于菌株EN16；病程相關蛋白結果進一步說明菌株SW1可以誘

8、導煙草葉片中多種PR蛋白的大量積累，其誘導蛋白譜與乙酰水楊酸的有較大一致性，而EN16誘導后PR蛋白積累量較小，與乙酰水楊酸的不完全相同。 誘變試驗表明，菌株SB1的抑病作用與其胞外液的活性呈正相關性。為了提高胞外活性物質的產(chǎn)量，對多種培養(yǎng)基進行篩選，結果表明，葡萄糖和礦物質可以促進活性物質的分泌。對抗菌物質理化性質的分析表明，SB1分泌的抗菌物質對熱穩(wěn)定、對紫外線和蛋白酶有較好的耐受力，具有水溶性和脂溶性特點。采用柱層析和高效

9、液相技術，分離并鑒定了PD培養(yǎng)上清液中的抗菌成分為表面活性素，PCR技術檢測SBl菌株中的抗菌素基因，結果表明，SB1菌株中的表面活性素合成基因srfA與報道序列(BACSRFAB)同源性達98％，菌株中伊枯草菌素合成基因ituB與報道的伊枯草菌素A的序列(AB050629)同源性達97.2％。進一步用電鏡觀察、紫外光譜掃描和SDS-PAGE分析SB1菌株抗菌成分對青枯病菌的拮抗機理，結果顯示，處理后細菌胞質濃縮，細胞裂解，DNA呈現(xiàn)明

10、顯的增色效應，同時胞內(nèi)和胞外蛋白質的表達量均受到了影響。 以含有抗菌素基因的質粒為模板，PCR合成表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和抗菌蛋白TasA的地高辛標記探針，采用斑點雜交技術對24個菌株的相關基因加以檢測，并用競爭ELISA法分析陽性樣品中表面活性素基因的表達情況。結果表明，以陽性質粒為模板，獲得1200 bp、1479 bp和790 bp的3個特異性探針，其檢測靈敏度分別為2、20和0.1