辣椒疫霉病生防芽孢桿菌快速篩選及菌株B006的代謝活性物質(zhì)研究.pdf

1、本文通過(guò)對(duì)芽孢桿菌生物膜能力的檢測(cè),生防功能基因的擴(kuò)增,室內(nèi)幼胚感病率法評(píng)價(jià)其防病效果及溫室防病效果的驗(yàn)證,建立了一種防止辣椒疫霉病生防芽孢菌的快速篩選方法,并對(duì)高效菌株菌株B006產(chǎn)生的脂肽類抗生物質(zhì)surfactin進(jìn)行了一系列的研究,具體結(jié)果如下：
　　 ⑴采用聚丙烯酰胺管掛壁方法測(cè)定了實(shí)驗(yàn)室保存的93株芽孢菌產(chǎn)生生物膜的能力,獲得48株產(chǎn)生生物膜菌株,采用生防功能基因srfAA、srfAB、ituC和fenD特異引物相對(duì)

2、應(yīng)的功能基因進(jìn)行了擴(kuò)增。并以辣椒疫霉為目標(biāo)病原菌,采用幼胚感病率法對(duì)上述有生物膜且／或可擴(kuò)增到生防功能基因的菌株進(jìn)行室內(nèi)的防病效果評(píng)價(jià),獲得防效50％以上的菌株15株。對(duì)其中生物膜產(chǎn)生級(jí)別、功能基因和室內(nèi)防效不同的8株菌進(jìn)行溫室防病效果的評(píng)價(jià),并對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行綜合分析,結(jié)果表明生物膜為3級(jí),可擴(kuò)增到基因srfAA、srfAB、fenD,幼胚感病率法篩選中防效較好的菌株,溫室防病效果也較好,防治效果可達(dá)70％以上；生物膜為2級(jí),可擴(kuò)增到s

3、rfAA、srfAB、ituC和fenD基因片段的菌株,幼胚感病率法評(píng)價(jià)結(jié)果與溫室防病效果基本一致,從而建立了生物膜的檢測(cè),功能基因的擴(kuò)增及幼胚感病率法評(píng)價(jià)相結(jié)合的生防芽孢桿菌的快速篩選方法,該方法對(duì)其他病害生防菌的篩選具有一定的借鑒意義。
　　 ⑵平板拮抗測(cè)定表明：溫室實(shí)驗(yàn)中選取的8株芽孢桿菌對(duì)辣椒疫霉病菌和黃瓜枯萎病菌均有顯著的抑制作用,但菌株B006的粗提品和發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用明顯好于對(duì)辣椒疫霉病菌的抑制作用。

4、HPLC-MS檢測(cè)表明,芽孢桿菌B006的粗提品中可以檢測(cè)到surfactin和fengycin,其中surfactin含量比較高。通過(guò)比較菌株B006在KMB、NA、SWB和Landy培養(yǎng)液中surfactin含量,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液KMB利于surfactin的產(chǎn)生,對(duì)芽孢桿菌B006在KMB培養(yǎng)液中不同培養(yǎng)時(shí)間的surfactin的HPLC-MS檢測(cè)表明,培養(yǎng)72h時(shí)surfactin產(chǎn)量最高。
　　 ⑶通過(guò)使用固相萃取柱(SPE

5、)對(duì)KMB培養(yǎng)液的發(fā)酵液樣品進(jìn)行濃縮和提純,研究了SPE柱不同淋洗條件下對(duì)surfactin提取影響,結(jié)果表明淋洗液甲醇與水的體積比為1:1時(shí)surfactin的提取效果好于體積比為95:5的提取效果；采用體外添加發(fā)酵液于滅菌土中再提取回收的方法研究了土壤對(duì)surfactin吸附作用的影響,發(fā)現(xiàn)土壤的吸附作用對(duì)surfactin提取的影響不明顯。對(duì)灌根法和基質(zhì)中添加B006菌劑培育辣椒植株,對(duì)根上surfactin的HPLC-MS檢測(cè)表