凝溶膠蛋白對胃癌細胞的影響【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　凝溶膠蛋白對胃癌細胞的影響</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品質(zhì)量與安全

2、 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b></p

3、><p><b>　　0 引 言12</b></p><p>　　1 材料和方法13</p><p>　　1.1凝溶膠蛋白的Ni柱純化13</p><p>　　1.2 SDS-PAGE電泳分析純化情況13</p><p>　　1.3培養(yǎng)基的配置14</p><p>　

4、　1.3.1準備和安裝過濾器14</p><p>　　1.3.2合成培養(yǎng)基的配制14</p><p>　　1.3.3小牛血清的處理15</p><p>　　1.3.4生長培養(yǎng)基的配制15</p><p>　　1.4細胞培養(yǎng)15</p><p>　　1.5 MTT法測定凝溶膠蛋白對癌細胞的生長影響15<

5、/p><p>　　1.5.1 MTT的配制15</p><p>　　1.5.2 MTT染色與觀察15</p><p>　　1.6細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染15</p><p><b>　　2 操作要點16</b></p><p>　　2.1 細胞培養(yǎng)中要注意的事項16&l

6、t;/p><p>　　2.2 MTT法測吸光度16</p><p>　　MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢16</p><p>　　3 實驗結(jié)果和討論16</p><p>　　3.1 凝溶膠蛋白的純化17</p><p>　　凝溶膠蛋白純化電泳圖見圖1，圖中由左至右四個泳道標號為1、2

7、、3、4、5、6，分別為標準電泳17</p><p>　　3.2 MTT法測凝溶膠蛋白對胃癌細胞的影響17</p><p>　　3.2.1 MTT法測得凝溶膠蛋白處理胃癌細胞原始數(shù)據(jù)17</p><p>　　3.2.2 根據(jù)MTT法測得光照密度計算不同濃度凝溶膠蛋白溶液對胃癌細胞的抑制率18</p><p>　　3.3 熒光染色法檢測

8、凋亡細胞的形態(tài)學變化19</p><p>　　選取的加入20μg/ml凝溶膠蛋白溶液處理的胃癌細胞進行熒光染色實驗，在熒光顯微鏡下可見，隨著凝溶膠蛋白給藥劑量的增加，呈亮藍色細胞的比率逐漸增加，并呈劑量依賴關(guān)系，提示19</p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻21</b></p>

9、<p>　　附 錄錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘 要：凝溶膠蛋白 (gelsolin) 是凝溶膠蛋白超家族的成員之一，是一種重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白，許多研究發(fā)現(xiàn)凝溶膠蛋白（gelsolin）在多種腫瘤中表達明顯降低。本實驗在培養(yǎng)的胃癌細胞中加入凝溶膠蛋白，通過 MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）比色法和熒光染色法觀察凝溶膠蛋白對胃癌細胞的作用，探究加入凝溶

10、膠蛋白的胃癌細胞生長是否受到了抑制。結(jié)果顯示，與未加入凝溶膠蛋白培養(yǎng)的胃癌細胞相比，加入凝溶膠蛋白培養(yǎng)的胃癌細胞中出現(xiàn)凋亡期的細胞和已死亡的細胞，表明凝溶膠蛋白對胃癌細胞的生長起到了抑制作用，且加入凝溶膠蛋白的濃度越大，抑制作用越明顯。</p><p>　　關(guān)鍵詞：凝溶膠蛋白；肌動蛋白結(jié)合蛋白 ；肌動蛋白；MTT比色法；熒光染色</p><p>　　Abstract：Gelsolin is

11、 one of members of the gelsolin superfamily and is an important actin binding protein. Many studies have found that gelsolin in a variety of tumors was significantly reduced. In this study, gastric cancer cells in cultur

12、e by adding gelsolin were observed by MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide） assay and fluorescent staining, and explore the added gelsolin whether gastric cancer cell growth was inhibited. The

13、 results showed that compared to gastric</p><p>　　Key words：Gelsolin ;Actin-binding protein; Actin；MTT Colorimetry; Fluorescence dyeing</p><p><b>　　0 引 言</b></p><p>　　凝溶

14、膠蛋白是一種普遍存在且進化高度保守的肌動蛋白結(jié)合蛋白。細胞能在特定的時間、空間調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合-解聚過程。能與肌動蛋白結(jié)合兵調(diào)節(jié)其聚合-解聚作用的一類蛋白統(tǒng)稱為肌動蛋白結(jié)合蛋白 [1]。目前，在生物界里已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十個種類，凝溶膠蛋白是在其中探究的比較清楚的一個種類。且凝溶膠蛋白最早于1979年[2]在兔的肺巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)，證實了凝溶膠蛋白能以鈣以來的方式調(diào)節(jié)肌動蛋白重組的功能，因而將這個蛋白命名為凝溶膠蛋白[3]。之后，人們在血小板細

15、胞中[4]和血清中[5]也發(fā)現(xiàn)了此類蛋白。凝溶膠蛋白是細胞骨架蛋白的重要組成成分之一，生物活性和功能多種多樣，在諸如細胞運動型、細胞骨架結(jié)構(gòu)動力學重排過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡的控制，甚至是腫瘤發(fā)生過程的調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用[6,7]。</p><p>　　凝溶膠蛋白由3個或者6個同源的結(jié)構(gòu)相似的片段組成[8]。目前，已獲得的大多數(shù)物種的凝溶膠蛋白有6個相似的結(jié)構(gòu)域。肌動蛋白微絲的排列與組裝受到大約100種

16、肌動蛋白結(jié)合蛋白的調(diào)控。凝溶膠蛋白便是其中之一[9]。凝溶膠蛋白在多種類型細胞中也均有表達，在胚胎期肌肉表達量最多[10]。凝溶膠以及家庭的其他切割蛋白，切斷蛋白能夠結(jié)合兩種單體和聚合物肌動蛋白[11]。</p><p>　　癌細胞的重要特征包括無序生長和高遷移能力是轉(zhuǎn)移性，而這兩個過程都涉及到細胞肌動蛋白骨架的解聚與重排。已報道凝溶膠蛋白在人類多種惡性腫瘤中表達明顯降低，其表達水平與腫瘤大小、侵襲性生長等密切相

17、關(guān)，如在人膀胱癌中，凝溶膠蛋白在6個膀胱癌細胞系和77.8%的膀胱癌組織中表達缺失和明顯降低[12]。人們對凝溶膠蛋白在腫瘤中表達明顯降低的現(xiàn)象進一步進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)將外源凝溶膠蛋白cDNA全長轉(zhuǎn)入癌細胞系過表達后，可抑制腫瘤細胞的生長，降低腫瘤細胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性[13,14]。重組腺病毒編碼的野生型凝溶膠蛋白轉(zhuǎn)入膀胱癌細胞系后可以使細胞停滯于G2/M期，原位膀胱癌動物模型經(jīng)Ad-GSN治療后，腫瘤體積縮小了90%，這些

18、實驗證據(jù)提示凝溶膠蛋白具有明顯的腫瘤抑制作用[15,16]。</p><p>　　細胞凋亡過程是半胱天冬酶所激活的，半胱天冬酶是一種在細胞凋亡期間大量出現(xiàn)的細胞核受動器蛋白酶。在活體外的實驗環(huán)境下，凝溶膠蛋白是良好的CPP3培養(yǎng)基[17,18]。已知在哺乳動物中共有14種此類蛋白家族的成員，其中半胱天冬氨酸-3是細胞凋亡過程中關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細胞凋亡過程中的多種關(guān)鍵蛋白，其目標之一就是凝溶膠蛋白[19

19、]。而且在凝溶膠蛋白基因敲除的小鼠神經(jīng)元細胞中，缺氧引起的細胞凋亡作用的增強，支持了凝溶膠蛋白能抑制細胞凋亡的假設(shè)。磷酸磷脂酰肌醇與凝溶膠蛋白的緊密結(jié)合，能夠消除由凝溶膠蛋白介導(dǎo)的抑制細胞凋亡的作用，這說明了凝溶膠蛋白抑制凋亡的作用可能主要取決于它構(gòu)象和與肌動蛋白結(jié)合的能力[20]。凝溶膠蛋白在細胞凋亡的多種病理過程中發(fā)揮了一定的作用。比如，在老年癡呆癥中，β-淀粉樣肽可以誘導(dǎo)線粒體的機能紊亂和半胱天冬酶的活化，從而之勢神經(jīng)元凋亡[21

20、]。</p><p>　　凝溶膠蛋白可以直接作用在肌動蛋白，對很多生理活動有著重要的影響。伴隨著分子遺傳學和體外分析技術(shù)的發(fā)展，對凝溶膠蛋白在各個領(lǐng)域也進行了廣泛的試驗來進行研究，但是凝溶膠蛋白對肌動蛋白的作用機制和調(diào)節(jié)作用并沒有真正的了解完善。其對肌肉的功能性作用和作用的機制等都需要進行進一步的研究。成肌纖維細胞是主要的傷口愈合和各種組織纖維中起細胞，在傷口的正常愈合中，成肌纖維細胞很短時間的純在，可以促進收縮

21、，加快結(jié)締組織的生長，但是在纖維化病變的組織中，成肌纖維細胞卻不能按時的從病變的地方退出來，導(dǎo)致細胞外的基質(zhì)持續(xù)過量分泌，造成組織結(jié)構(gòu)的重塑，最終功能衰竭，這種特征是組織的纖維化[22，23]。肌動蛋白作為一個重要的肌肉細胞收縮的蛋白，也是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，其表達量的多少能直接反應(yīng)成肌纖維細胞的分化、增值及凋亡情況，而凝溶膠蛋白又在肌動蛋白纖絲聚合及解聚的動態(tài)變化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，因此研究凝溶膠蛋白對成肌纖維細胞的功能性作用具

22、有重要的理論意義，可通過分子生物學技術(shù)阻斷其分化、增殖的信號通路及基因轉(zhuǎn)錄，通過藥物或重組蛋白促進成肌纖維細胞的凋亡，抑制其分化和增殖，促其恢復(fù)轉(zhuǎn)化前細胞表型，從而阻斷纖</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p>　　材料：3 000 mL錐形瓶，250 mL或500 mL培液瓶，翻帽塞，飯盒，pH試紙，孔徑0．22 μm的微孔濾膜，酒精燈，

23、移液槍，離心管。 藥品： NaH2PO4溶液，NaCl溶液，imidazole(pH 8.0)，30% Acr/Bis，1.5mol/L pH8.8 Tris，0.5mol/L pH6.8 Tris，10% SDS，10% AP，TEMED，鹽酸，無離子水，小牛血清，合成培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，青霉素，鏈霉素，NaHC03。修哈四氮唑藍，Hoechst染色試劑盒，胃癌細胞株。 儀器： 濾泵1套，濾器1套，蒸

24、餾器，高壓滅菌鍋，離心機，磁力攪拌器，XSZ-D2型熒光顯微鏡，BIO-RAD680型酶標儀， DYY-12型三恒電泳儀。</p><p>　　1.1凝溶膠蛋白的Ni柱純化</p><p>　　由于重組表達的凝溶膠蛋白是以可溶性的形式存在于細胞質(zhì)中，所以采用Ni-NTA，在非變性條件下進行分離純化。具體過程如下：1）菌體用Lysis Buffer（50 mM NaH2PO4，300 mM

25、 NaCl，10 mM imidazole，pH 8.0）懸浮，超聲破碎儀破碎后，收集可溶性上清。2）Ni-NTA離心后，用Lysis Buffer洗滌兩次。加入細菌可溶性上清，在冰上輕微混勻1h，使重組蛋白充分地與Ni-NTA相作用。3）12，000×g，離心10sec后，Ni-NTA用Wash Buffer（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，40 mM imidazole(pH 8.0)）充分洗滌兩次

26、，棄上清。4）12，000×g，離心10sec后，Ni-NTA用Elution Buffer（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM imidazole(pH 8.0)）洗滌三次，上清為含有重組蛋白的洗脫液。</p><p>　　1.2 SDS-PAGE電泳分析純化情況</p><p>　　1）安裝玻璃板；2)配置分離膠；按照表1中的順序加入所需的溶

27、液，加完TEMED后聚合反應(yīng)開始，立刻混勻溶液灌膠。3)灌膠；將分離膠灌至兩層玻璃板之間的間隙中，注意要給濃縮膠流出一定的空間（齒梳長再加1cm）。然后用吸管在分離膠上覆蓋一層異丙醇（丙烯酰胺濃度為10%左右）或者是0.1%SDS（丙烯酰胺濃度為8%左右）。置于室溫或者是37 ℃。4)聚合完成后（約30min），用濾紙將覆蓋液吸走，用去離子水清洗凝膠的頂部數(shù)次（3次）以去除為聚合的丙烯酰胺。再用濾紙將水吸走。5)按照表1中的體積制

28、備濃縮膠。6)將濃縮膠直接灌裝在聚合好的分離膠上，立即在其中插入一塊干凈的齒梳，注意不要混入氣泡。置于室溫或者是37 ℃聚合30min左右。7)聚合后，將齒梳取出，用去離子水將未聚合的丙烯酰胺清洗。</p><p>　　表1 SDS-PAGE電泳的配置</p><p>　　Tab.1 Configuration of Sds-page electrophoresis</p>

29、<p><b>　　8)安裝電泳裝置。</b></p><p>　　9)點樣。每個樣品上樣10ml。</p><p>　　10)電泳。先在凝膠上加8V/cm電壓，待染料前沿進入分離膠后將電壓調(diào)節(jié)到15V/cm繼續(xù)電泳，直至溴酚藍到達分離膠的底部，然后關(guān)閉電源。注：這里的長度指的是分離膠和濃縮膠的總長。</p><p>　　11)卸

30、下玻璃板，小心撬開玻璃板，標注凝膠的方向。</p><p>　　12)考馬斯亮藍染色和脫色：將凝膠置于裝有考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍R-250 1g，250ml 異丙醇，100ml冰醋酸，加650去離子水）大平皿中，搖床上過夜。第二天將凝膠置于脫色液（100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml去離子水）中脫色，第三天來觀察結(jié)果。將結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上掃描，保存結(jié)果。</p><p

31、><b>　　1.3培養(yǎng)基的配置</b></p><p>　　組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細胞外液相似。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細胞生長所必須的生長因子、激素、貼附因子等，這是合

32、成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細胞時要加入一定量的小牛血清(10％。20％)。</p><p>　　1.3.1準備和安裝過濾器 </p><p>　　清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0．22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用

33、濾泵做正壓過濾，壓力數(shù)字為2。 過濾后要檢查濾膜是否完好無損。</p><p>　　1.3.2合成培養(yǎng)基的配制</p><p>　　去離子水用蒸餾器進行重新蒸餾(去除無機和有機雜質(zhì))，制3 000 mL三蒸水。三蒸水應(yīng)及時使用，如果放置一段時間，則使用前須高壓處理(15磅20 min)。2）待水溫降至15—30℃，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時間(2—4 h)使之充分溶解。3）配

34、制RPMll640培養(yǎng)基時應(yīng)通入適量C02或加入6 mol／L鹽酸調(diào)pH至6．0左右，這樣才能充分溶解。4）加入一定量NaHCO，調(diào)節(jié)pH至7．0左右。5）加水至最終體積。6）在超凈臺中對溶液進行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。7）瓶口封好，4℃冰箱貯存(RPMI1640培養(yǎng)基可以-20℃貯存)。</p><p>　　1.3.3小牛血清的處理 </p>&

35、lt;p>　　市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體。1）將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。2）處理后的血清貯存于4℃。</p><p>　　1.3.4生長培養(yǎng)基的配制 </p><p>　　此次試驗中用到的培養(yǎng)基需加入青霉素和鏈霉素。1)培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL

36、)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。2)按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80％－90％，小牛血清占10％－20％。 按1％體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100μ／mL和100μ／mL。</p><p><b>　　1.4細胞培養(yǎng)</b></p><p>　　在無菌操作室內(nèi)，將癌細胞株接種于含15%小牛血清的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置

37、于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中進行隔夜培養(yǎng)（12h）。</p><p>　　1.5 MTT法測定凝溶膠蛋白對癌細胞的生長影響</p><p>　　1.5.1 MTT的配制</p><p>　　預(yù)先在50ml離心管加入20ml PBS，從中先吸取500-1000μl PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜?fù)幾次，以

38、使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養(yǎng)板每孔需加10μl計算，一般每96孔板約需1ml。</p><p>　　1.5.2 MTT染色與觀察</p><p>　　收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100μl,鋪板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔

39、用無菌PBS填充）。2）5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,在前一天下午鋪板，次日上午加藥,每孔100μl,設(shè)3-5個復(fù)孔.3）5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4）每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。5）終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6）每孔加入150μl二甲基亞砜（可以直接溶解，無需配制），置搖床上低速振蕩10min，

40、使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7）同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）</p><p>　　1.6細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染</p><p>　　表2 細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染試劑盒組分</p><p>　　T

41、ab.2 Components of the Fluorescent double staining of apoptosis kit Hoechst33342/PI</p><p>　　1)選取加入20μg/ml凝溶膠蛋白溶液處理的胃癌細胞，在培養(yǎng)24h后，吸盡培養(yǎng)液，消化收集后，將105~106個細胞懸浮于1mL培養(yǎng)基中，再加入10μL Heochst 33342 染液，混勻，370C孵育5～15 min；

42、2）細胞于 40C ，500～1000r/min離心5min棄去上清液；3）加入1.0mLBuffer A工作液(用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍)懸浮細胞，加入5μL PI染液，室溫避光放置5～15min后混勻； 4）熒光顯微鏡觀察： Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長為352nm，發(fā)射波長為400～500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射

43、光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。</p><p><b>　　2 操作要點</b></p><p>　　2.1 細胞培養(yǎng)中要注意的事項</p><p>　　此次試驗需要進行多天，每天需要對培養(yǎng)的胃癌細胞更換培養(yǎng)基。由于每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的培養(yǎng)基，所以在更換培養(yǎng)基時，要使用與前次相同的培養(yǎng)基。因此，在配置培養(yǎng)基時，要多做一些備

44、用，以免試驗后期培養(yǎng)基不夠。 此次試驗需要進行胃癌細胞的體外培養(yǎng)，在細胞體外培養(yǎng)的過程中，混入雜菌會嚴重影響試驗的結(jié)果。所以在實驗過程中，包括培養(yǎng)基的保存過程，實驗器材的準備過程，細胞的培養(yǎng)過程中，要對雜菌污染進行嚴格的控制。培養(yǎng)基滅菌后需密封保存，實驗器材在使用前也要進行嚴格的滅菌處理。需要在無菌試驗室進行胃癌細胞的培養(yǎng)。最大限度的控制雜菌污染。</p><p>　　2.2 MTT法測吸光度</

45、p><p>　　MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性

46、檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。因此，此次試驗中選取,MTT法測定胃癌細胞的吸光度。 但由于MTT有致癌性，所以在配置時要注意，帶好透明的薄膜手套，避免MTT與皮膚直接接觸。且MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，在實驗中將MTT小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。在實

47、驗前把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，不能一次性配置太多，當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。</p><p><b>　　3 實驗結(jié)果和討論</b></p><p>　　3.1 凝溶膠蛋白的純化</p><p>　　凝溶膠蛋白純化電泳圖見圖1，圖中由左至右四個泳道標號為1、2、3、4、5、6，分別為標準電泳，凝溶膠蛋

48、白溶液，上清液、沉淀、純化后的上清液和純化后的沉淀電泳。 </p><p>　　圖1 凝溶膠蛋白電泳圖</p><p>　　Fig.1 Eectrophoresis of gelsolin</p><p>　　3.2 MTT法測凝溶膠蛋白對胃癌細胞的影響</p><p>　　3.2.1 MTT法測得凝

49、溶膠蛋白處理胃癌細胞原始數(shù)據(jù)</p><p>　　本次MTT實驗為每隔4h、8h、24h、48h和72h測定一次，將取得的光照密度值列表整理。發(fā)現(xiàn)凝溶膠蛋白對胃癌細胞具有較強的抑制作用，當凝溶膠蛋白的濃度為20μg/ml、2μg/ml和0.2μg/ml時，根據(jù)MTT法得出吸光度（OD）見表3（以ck表示不加入凝溶膠蛋白培養(yǎng)的胃癌細胞，作為對照組，以ck表示）。按表3數(shù)據(jù)做出不同濃度凝溶膠蛋白處理下細胞生長狀況曲線

50、，如圖2。</p><p>　　表3不同濃度凝溶膠蛋白處理下細胞吸光度值Tab.3 Light density of Gastric cancer cells in Different concentrations of gelsolin</p><p>　　圖2不同濃度凝溶膠蛋白處理下胃癌細胞光照密度值Fig.2Light density of Gastric cancer cell

51、s in Different concentrations of gelsolin</p><p>　　3.2.2 根據(jù)MTT法測得光照密度計算不同濃度凝溶膠蛋白溶液對胃癌細胞的抑制率</p><p>　　由表3可以看出，凝溶膠蛋白溶液對胃癌細胞生長具有抑制作用。則可以根據(jù)公式：胃癌細胞存活率=凝溶膠蛋白藥物組光密度值/細胞對照組光密度值×100%，抑制率=100%-存活率。來計

52、算不同濃度凝溶膠蛋白溶液對培養(yǎng)的胃癌細胞的抑制率，見表4.根據(jù)得出的抑制率數(shù)據(jù)，做出不同濃度凝溶膠蛋白處理下的胃癌細胞抑制率曲線如圖3。</p><p>　　表4 不同濃度凝溶膠蛋白對胃癌細胞的抑制率Tab.4 Different concentrations of gelsolin inhibition rate of gastric cancer cells</p><p>　　圖3

53、不同濃度凝溶膠蛋白處理下的胃癌細胞抑制率Fig.3 Different concentrations of gelsolin in gastric cancer cells treated with inhibitory rate</p><p>　　根據(jù)圖2和圖3可以看出，加藥組的細胞生長受到明顯的抑制，在處理72h后，加入20μg/ml、2μg/ml和0.2μg/ml凝溶膠蛋白溶液的胃癌細胞抑制率分別為55

54、.52%、32.94%、14.55%?？梢缘贸觯苣z蛋白對胃癌細胞有抑制作用，且凝溶膠蛋白濃度在0.2μg/ml到20μg/ml范圍內(nèi)時，凝溶膠蛋白溶液濃度為20μg/ml時，對胃癌細胞的抑制最為明顯。</p><p>　　3.3 熒光染色法檢測凋亡細胞的形態(tài)學變化</p><p>　　選取的加入20μg/ml凝溶膠蛋白溶液處理的胃癌細胞進行熒光染色實驗，在熒光顯微鏡下可見，隨著凝溶膠蛋

55、白給藥劑量的增加，呈亮藍色細胞的比率逐漸增加，并呈劑量依賴關(guān)系，提示凝溶膠蛋白可以誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。圖4中A和B為未加入凝溶膠蛋白溶液培養(yǎng)的胃癌細胞熒光染色圖，C和D為加入凝溶膠蛋白溶液培養(yǎng)的胃癌細胞熒光染色圖。 細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染中，正?；罴毎麨榘邓{色，處在凋亡期的細胞染色為亮藍色，而已死亡的細胞染色為紅色。正常生長細胞的形狀規(guī)則，而凋亡期的細胞周圍出現(xiàn)許多小泡狀的凋亡體。在在胃癌細胞的熒光染色顯微

56、圖上可以看出，未加入凝溶膠蛋白的胃癌細胞生長正常，形狀規(guī)則，基本無凋亡期和死亡細胞，而加入凝溶膠蛋白的細胞染色顯微圖中，可以看到亮藍色的細胞周圍出現(xiàn)凋亡體處于凋亡期的細胞明顯增多，甚至出現(xiàn)死亡了的胃癌細胞細胞。證明凝溶膠蛋白影響了胃癌細胞的生長，促使了胃癌細胞的凋亡。</p><p>　　圖4細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染圖Fig.4 Fluorescent double staining ce

57、lls Hoechst33342/PI</p><p>　　凝溶膠蛋白作為一種細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白通過對肌動蛋白微絲骨架的調(diào)節(jié)效應(yīng)使其與細胞的運動、形態(tài)改變、生長調(diào)控及凋亡等重要的生物功能聯(lián)系起來,因此在許多生理和病理環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用[22]. 細胞周期與腫瘤細胞的生長、增殖、分化等有密切關(guān)系[9,10],腫瘤細胞是增殖失控細胞,不斷地增殖,最終導(dǎo)致機體的死亡。如果細胞周期不能正常運轉(zhuǎn),就會導(dǎo)致遺傳性能

58、紊亂、增殖分化異常和細胞癌變,甚至導(dǎo)致死亡[23]。 此次試驗中發(fā)現(xiàn)，加入凝溶膠蛋白溶液培養(yǎng)的胃癌細胞，多數(shù)進入了凋亡期，甚至有些胃癌細胞已經(jīng)死亡。說明，凝溶膠蛋白阻止了細胞周期的正常運轉(zhuǎn)，使得胃癌細胞的增殖異常。得出凝溶膠蛋白在體外具有明顯的抗癌活性的結(jié)論。此次實驗的MTT結(jié)果顯示，凝溶膠蛋白在濃度在0.2μg/ml至20μg/ml的區(qū)間內(nèi)，對胃癌細胞的生長均有抑制作用，且劑量越大，抑制作用越明顯。通過熒光染色實驗可以發(fā)現(xiàn)，凝

59、溶膠蛋白阻斷了細胞周期的正常運轉(zhuǎn)，使得胃癌細胞增殖速度逐漸減慢甚至終止，也能說明凝溶膠蛋白對胃癌細胞有著抑制作用。綜上所述,本文通過體外實驗證明了凝溶膠蛋白具有明顯的抑制腫瘤細胞生長活性，因此其有可能成為</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 韓曉曦，王繼紅，李慶偉. 凝溶膠蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 中國生物化學與分子生物化學報，2

60、007，23（5）：331~337.</p><p>　　[2] Lee WM,Galbraith RM. The extracellular actin-scavenger system and actin toxicity[J]. N Engl J Med，1992，326：1335~1341.</p><p>　　[3] Yin HL，Stossel TP. Control of c

61、ytoplasmic actin gel-sol transformation by gelsolin，a calcium-dependent regulatory protein[J]. Nature，1979，281：583~586.</p><p>　　[4] Snabes MC，Boyd AE，Bryan J. Detection of actin-binding proteins in human pl

62、atelets by 125I-actin overlay of polyacrylamide gels[J]. J Cell Bilo，1981，90（3）：809~812.</p><p>　　[5] Harris HE，Bamburg JR，Weeds AG. Actin filament disassembly in blood plasma[J]. FEBS Lett，1980，121（1）：175~1

63、77.</p><p>　　[6] Mcgough AM，Staiger CJ，Min JK， et al. The gelsolin family of actin regulatory proteins：modular structures，versatile functions[J]，F(xiàn)EBS Lett，2003，552（2-3）：75~81.</p><p>　　[7] 王旭濤，張

64、新超. 凝溶膠蛋白和危重病[J]. Chinese General Practice，2009，12（11）：2088~2091.</p><p>　　[8] Silacci P，Mazzolai L，Gauci C，et al. Gelsolin superfamily proteins:key regulators of cellular functions[J]. Cell Mol Life Sci，200

65、4，61(19-20):2614~2623.</p><p>　　[9] 汪勇沛，詹永樂. 日本血吸蟲凝溶膠蛋白基因在蟲體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平分析. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010，1: 48-49.</p><p>　　[10] 汪勇沛，詹永樂. 日本血吸蟲凝溶膠蛋白基因在蟲體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平分析. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010，1: 48-49.</p><p&g

66、t;　　[11] Jeanne Feinberg, Marie-christine Lebart, Yves Benyamin, and Claude Roustan Localization of a Calcium Sensitive Binding Site for Gelsolin on Actin Subdomain I :Implication for Severing Process BIOCHEMICAL AND BIO

67、PHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 233, 61–65 (1997)</p><p>　　[12] 孟憲敏，曹慧青，王震等.Nelin的肌動蛋白結(jié)合特性及與其相互作用蛋白質(zhì)的篩選[J]. 科學通報，2004，49（21）：2173~2177.</p><p>　　[13] 江奇峰，蔡紹皙，晏小清，等. 鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白及其磷酸化對癌細胞遷移能力的影響研究[J

68、]. 生物化學與生物物理進展，2010，37(3):326-336.</p><p>　　[14] 徐國恒. 細胞骨架——肌動蛋白纖維[J]. 生物學通報，2005，40(2): 43.</p><p>　　[15] 倪曉光. 凝溶膠蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其抑制腫瘤的作用[J]. 實用癌癥雜志，2007，22(1) :105-107.</p><p>　　[16] Ta

69、naka M, Mullauer L, OgisoY, et al. Gelsolin: acandidatefor suppressor of human bladder cancer[J]. Ca- ncerRes, 1995,55(15) :3228.</p><p>　　[17] David J Kwiatkowski Functions of gelsolin: motility, signaling,

70、 apoptosis, cancer</p><p>　　[18] Kamada S, Kusano H, Fujita H, Ohtsu M, Koya RC, Kuzumaki N, Tsujimoto Y: A cloning method for caspase substrates that uses the yeast two-hybrid system: cloning of the antiap

71、optotic gene gelsolin. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:8532-8537.</p><p>　　[19] Philchenkov A A. Caspases as regulators of apoptosis and other cell functions[J]. Biochemistry(Mosc)，2003，68(4):365~376.</p&

72、gt;<p>　　[20] Mejillano M , Yamamoto M , Rozelle A L, et al . Regulation of apoptosis by phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate inhibition of caspases,and caspaseinactivation of phosphatidylinositol phosphate 5-ki

73、nases[J].J Biol Chem,2001, 276 (3):1865~1872.</p><p>　　[21] Qiao H, Koya R C, Nakagawa K, et al .Inhibition of Alzheimer’s amyloid-beta peptide-induced reduction of mitochondrial membrane potential and neuro

74、toxicity by gelsolin[J]. Neurobiol Aging,2005, 26 (6):849~855.</p><p>　　[22] YAMAGU CHI H,CONDEELIS J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion[J].Biochim Biophys Acta,2007,