嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗腸道病原菌粘附或入侵宿主細胞機制的研究.pdf

1、S-層蛋白( S-layer protein)是乳酸桿菌表面的一層蛋白分子，近年來發(fā)現(xiàn)該蛋白對腸道病原菌具有拮抗作用。腸道病原菌主要是通過粘附或入侵、誘導(dǎo)細胞骨架重排和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、影響細胞凋亡達到入侵宿主上皮細胞的目的．拮抗和阻止病原茵的粘附及入侵作用是保護細胞免受感染的有效方法。本研究旨在探討乳酸桿菌S-層蛋白拮抗腸道病原菌的作用機制。首先提取和純化嗜酸乳酸桿菌的S-層蛋白，研究S-層蛋白對腸道病原菌的拮抗作用；然后應(yīng)用人結(jié)腸腺癌細

2、胞系（Caco-2細胞）作為體外模型，檢測S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門氏菌粘附及入侵Caco-2細胞的影響，包括細菌的粘附入侵、細胞骨架的變化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細胞凋亡中幾種因子的變化等，以期揭示乳酸桿菌S-層蛋白拮抗腸道病原菌粘附或入侵宿主細胞機制．主要分為以下五個試驗：試驗一：嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白的提取純化
　　 本試驗應(yīng)用已知具有S-層蛋白的嗜酸乳酸桿菌ATCC4356作為對照，從蛋白和基因兩個水平對36株豬十二腸分離得到的乳

3、酸桿菌進行S-層蛋白菌株篩選，然后提取純化S-層蛋白并制備抗血清。結(jié)果顯示：36株乳酸桿菌均不存在S-層蛋白．本試驗提取純化得到嗜酸乳酸桿菌的S-層蛋白，應(yīng)用該S-層蛋白接種新西蘭兔，制備得到S-層蛋白抗血清，瓊擴效價為1：16。本試驗表明乳酸桿菌S-層蛋白只存在于某些菌株中。試驗二：嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白對腸道病原菌粘附或入侵的拮抗作用
　　 首先應(yīng)用三種不同的粘附試驗：競爭試驗( competition assay)、排斥試

4、驗(exclusionassay)和置換試驗(displacement assay)，分別研究S-層蛋白對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌SL1344粘附或入侵Caco-2細胞的拮抗作用，然后應(yīng)用Dot-blot方法檢測S-層蛋白與兩種細菌及Caco-2細胞的結(jié)合。結(jié)果顯示：S-層蛋白能夠顯著協(xié)同產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對Caco-2細胞的粘附．排斥試驗和競爭試驗的相對粘附力分別為452.30％±2.26%（P<0.01）和155.57%

5、±5.81%(P<0.05)．S-層蠶白在排斥試驗中，對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的協(xié)同粘附高于競爭試驗。嗜酸乳酸桿菌也表現(xiàn)出明顯的協(xié)同產(chǎn)腸毒素大腸桿菌粘附的效應(yīng)．相反，S-層蛋白則能顯著地拮抗鼠傷寒沙門氏菌的粘附及入侵。在競爭、排斥、置換三種粘附試驗中，S-層蛋白可顯著降低鼠傷寒沙門氏菌的粘附，其相對粘附力分別為1.17%±5.97%、8.71%±1.36%，10.56%±0.92%，差異極顯著（P<0.01），其中競爭試驗效果最好；并且S-層

6、蛋白對鼠傷寒沙門氏菌粘附拮抗作用極顯著高于嗜酸乳酸桿菌(P<0.01)；此外，S-層蛋白也能顯著拮抗鼠傷寒沙門氏菌入侵。Dot-blot顯示，S-層蛋白均可在兩種細菌和Caco-2細胞表面自我組裝。本試驗表明，S-層蛋白協(xié)同增加產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌對Caco-2細胞的粘附；卻可顯著拮抗鼠傷寒沙門氏菌對Caco-2細胞的粘附及入侵。S-層蛋白可能通過與鼠傷寒沙門氏菌競爭粘附受體，修飾細菌或Caco-2細胞表面相關(guān)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)拮抗作用．試驗三：嗜

7、酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門氏菌對細胞骨架的研究
　　 鼠傷寒沙門氏菌粘附或入侵宿主細胞過程中可顯著引起細胞骨架變化。在試驗二的基礎(chǔ)上，本試驗首先研究S-層蛋白對鼠傷寒沙門氏菌SL1344感染Caco-2細胞微線毛和上皮完整性的變化；然后研究S-層蛋白抗感染過程中對Caco-2細胞微絲分布及其微絲相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白Racl表達的影響．結(jié)果顯示：鼠傷寒沙門氏菌感染Caeo-2細胞后，可引起上皮細胞微絨毛變短，細胞微絲排列紊亂，細胞

8、跨膜電阻下降。嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白則能夠拮抗鼠傷寒沙門氏菌對細胞微絲骨架的改變，并可減少鼠傷寒沙門氏菌引起Caco-2細胞跨膜電阻的破壞。鼠傷寒沙門氏菌可使Caco-2細胞Racl蛋白的表達量顯著升高（0.39-0.02 VS0.15-0.01；P<0.001），而S-層蛋白則可極顯著上調(diào)感染鼠傷寒沙門氏菌后Caco-2細胞Rael蛋白的表達(0.58+0.01 VS0.39-0.02;P<0.01)．本試驗表明嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白

9、可能通過拮抗鼠傷寒沙門氏菌對細胞微絨毛和微絲骨架的破壞；上調(diào)Rae1蛋白表達來拮抗鼠傷寒沙門氏茵的粘附及入侵。試驗四：嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門氏菌對細胞MAPK信號通路的研究
　　 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號通路對病原菌的防御發(fā)揮重要作用。本試驗研究了S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門氏菌SL1344過程中對Caco-2細胞MAPK信號通路三種重要亞族E

10、RK、JNK和p38的影響。結(jié)果顯示：鼠傷寒沙門氏菌感染Caco-2細胞后，ERKl/2(0.34±0.02 VS0.04±0.01；P<0.001)、JNK(1.77±0.19 VS0.88±0.10; P<0.01)和p38(0.93±0.07 VS0.72±0.02;P<0.05)的磷酸化水平均顯著升高。S-層蛋白可明顯增加Caco-2細胞ERKl/2的磷酸化(0.54±0.04;P<0.001)，而不影響JNK與p38的活化。當(dāng)

11、S-層蛋白與鼠傷寒沙門氏菌共孵育后，細胞ERK1/2磷酸化水平(0.12±0.01)極顯著低于分別單獨作用細胞后的水平(P<0.001)，并且S-層蛋白可以顯著拮抗鼠傷寒沙門氏菌對Caeo-2細胞JNK(0.64±0.05 VS1.77±0.19;P<0.01)和p38(0.61±0.04 VS0.93±0.07;P<0.05)的磷酸化。本研究表明S-層蛋白可能阻斷細菌對MAPK信號通路的活化發(fā)揮拮抗鼠傷寒沙門氏菌的作用。試驗五：嗜酸乳

12、酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門氏菌對細胞凋亡的研究
　　 病原菌可誘導(dǎo)上皮細胞凋亡，主要表現(xiàn)為推遲凋亡時間，引起凋亡損傷，本試驗首先研究鼠傷寒沙門氏菌引起Caco-2細胞凋亡的途徑；然后研究嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門氏菌感染引起細胞凋亡的機理。結(jié)果顯示：鼠傷寒沙門氏菌顯著誘導(dǎo)Caco-2細胞的凋亡造成損傷。鼠傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)Caco-2細胞凋亡并不激活Caspase-1，而是顯著誘導(dǎo)Caspase-3的活化。S．層蛋白