兩種乳酸桿菌的S-層蛋白對HT-29細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能研究.pdf

1、S-層蛋白是位于一些細(xì)菌細(xì)胞壁外層的一種蛋白成分。乳酸桿菌的S-層蛋白對其發(fā)揮益生功能具有重要作用。許多研究證實(shí)乳酸菌定殖于宿主腸道中，能夠?qū)λ拗鞯拿庖呦到y(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而S-層蛋白作為其最外層成分，其參與乳酸桿菌拮抗病原菌黏附及入侵宿主細(xì)胞、保護(hù)乳酸桿菌在胃腸道中維持正常的生物活性等方面具有重要作用。但是，目前關(guān)于S-層蛋白對宿主細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究較少，所以本課題以宋內(nèi)志賀菌作為炎性刺激物，研究從Lactobacillus

2、paracasei subsp.paracasei M5-L和Lactobacillus casei Q8-L兩種乳酸桿菌上分離的S-層蛋白對HT-29細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　采取5mol/L的LiCl提取S-層蛋白，并利用1mol/L的LiCl通過鹽析的方法來純化粗提蛋白，SDS-PAGE檢測表明兩株菌均在45kDa處有單一條帶。調(diào)整S-層蛋白濃度作用細(xì)胞，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)最終確定其作用濃度為100μg/mL，Shigella s

3、onnei與細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)為20:1，作用時(shí)間為6h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了兩種S-層蛋白能夠抑制S.sonnei對HT-29細(xì)胞增殖的影響，在作用時(shí)間為6h時(shí)，預(yù)防組及治療組具有明顯的效果；在作用時(shí)間為12h時(shí)，則為競爭組的效果較好。通過對倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，再次證實(shí)了S-層蛋白能夠拮抗S.sonnei對細(xì)胞活性的有害影響。
　　通過對細(xì)胞上清液中NO含量的檢測，證明兩種S-層蛋白能夠降低S.

4、sonnei引起的細(xì)胞過度分泌NO，并且這種抑制作用與濃度有關(guān)。通過ELISA測定細(xì)胞分泌的IL-8、IL-10、TNF-α、IL-1β的水平及RT-PCR對相應(yīng)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)情況的研究，證實(shí)了兩種S-層蛋白能夠在基因及蛋白水平誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子IL-10，同時(shí)能夠在基因及蛋白水平拮抗S.sonnei刺激細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、IL-1β。進(jìn)一步通過Western Blot法對HT-29細(xì)胞的MAP

5、K信號(hào)通路進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩種S-層蛋白能夠通過降低p-JNK蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而拮抗S.sonnei對JNK信號(hào)通路的活化作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了S-層蛋白能夠通過對細(xì)胞因子及信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對宿主細(xì)胞的免疫作用進(jìn)行調(diào)控。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測HT-29細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況，證實(shí)兩種S-層蛋白均能夠調(diào)節(jié)S.sonnei導(dǎo)致的細(xì)胞周期紊亂的狀態(tài)，并對S.sonnei誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞大量增加的情況進(jìn)行抑制，進(jìn)一步證實(shí)了S-層蛋白能通過對S.