乳酸桿菌對LPS致敏小腸上皮細胞的免疫調(diào)節(jié)效應及機制研究.pdf

1、益生菌廣泛用于調(diào)節(jié)動物腸道健康，乳酸桿菌為應用最早、研究最多的益生菌菌種之一。乳酸桿菌通過其不同成分能夠介導動物胃腸道免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮益生效應，然而其免疫調(diào)節(jié)機制仍不明了。鑒于此，闡明乳酸桿菌具有怎么樣的腸道免疫調(diào)節(jié)功能，解析其免疫調(diào)節(jié)的信號通路及其關(guān)鍵靶點，將為益生菌免疫調(diào)節(jié)功能的開發(fā)提供科學依據(jù)，對篩選和培育高效乳酸桿菌等益生菌具有重要的實踐意義。
　　本試驗旨在以公認的標準益生乳酸桿菌——鼠李糖乳酸桿菌（Lactobaci

2、llus rhamnosus GG，LGG）為代表，同時分離并獲得LGG不同成分（表面蛋白SLP、胞外多糖EPS、基因組DNA以及人工合成的未甲基化CpG ODN），分析LGG及其不同成分對人工致敏體外培養(yǎng)腸上皮細胞的免疫調(diào)節(jié)效應和免疫保護作用，查明乳酸桿菌對小腸上皮細胞信號通路的調(diào)控作用，解析乳酸桿菌實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用的信號通路靶點，闡明乳酸桿菌發(fā)揮腸道免疫調(diào)控作用的分子機制。與此同時，以LGG作為參考菌株，構(gòu)建小鼠炎癥模型研究豬源乳酸

3、桿菌（高粘附菌株Lactobacillus reuteri ZJ617和低粘附菌株Lactobacillus reuteri ZJ615）對腸道的免疫調(diào)節(jié)作用，分析乳酸桿菌介導動物腸道免疫調(diào)節(jié)作用的機制。
　　本研究主要采用大腸桿菌 LPS分別誘導豬小腸上皮細胞系 IPEC-J2細胞和C57BL/6小鼠產(chǎn)生免疫反應，構(gòu)建炎癥模型以評定乳酸桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用。通過構(gòu)建豬小腸上皮細胞系IPEC-J2細胞脂多糖LPS炎癥模型，采用2×1

4、07 CFU/mL LGG或從LGG中分離純化獲得的不同成分（表面蛋白SLP、基因組DNA、胞外多糖EPS以及人工合成的未甲基化CpG ODN序列），分別預處理IPEC-J2細胞（1×106細胞/孔）4小時，再以脂多糖LPS刺激細胞。同時，通過構(gòu)建C57BL/6小鼠LPS炎癥模型，連續(xù)灌胃108 CFU/mL乳酸桿菌（LGG、ZJ617或ZJ615）一周后，腹腔注射LPS誘發(fā)炎癥。采用qRT-PCR技術(shù)檢測IPEC-J2細胞和小鼠腸道組

5、織致炎性細胞因子以及Toll樣受體（TLR）的mRNA水平。采用Western-blot技術(shù)、免疫組化和免疫熒光技術(shù)分別檢測IPEC-J2細胞和小鼠腸道組織中炎癥相關(guān)信號通路（NF-κB信號通路和MAPK信號通路）主要靶點蛋白的表達水平。
　　研究結(jié)果表明：1）與單純 LPS刺激豬腸上皮 IPEC-J2細胞相比，LGG預處理IPEC-J2細胞后顯著降低由LPS誘導的細胞致炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受體TL

6、R2、TLR4、TLR9的mRNA水平；細胞信號通路分子p38MAPK、ERK1/2和NF-κBp65的磷酸化水平顯著降低，而I-κBα表達量顯著上升（P<0.05）。2）與單純LPS刺激IPEC-J2細胞相比，LGG表面蛋白SLP和胞外多糖EPS預處理IPEC-J2細胞后能夠顯著降低由LPS誘導的細胞致炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受體TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平；細胞信號通路分子p38MAPK和N

7、F-κBp65磷酸化水平顯著降低，而I-κBα表達量顯著上升（P<0.05）。3）與單純LPS刺激IPEC-J2細胞相比，LGG未甲基化的CpG ODN預處理IPEC-J2細胞能夠顯著升高由LPS誘導的細胞致炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α水平和TLR受體TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平；信號通路分子p38MAPK、ERK1/2磷酸化水平與單純LPS刺激細胞相比沒有顯著差異（P<0.05）。4）與單純LPS刺激未經(jīng)

8、乳酸桿菌灌胃小鼠相比，LGG和低粘附力乳酸桿菌 ZJ615連續(xù)灌胃一周的小鼠接受 LPS刺激后，其腸道組織中炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受體TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平顯著下降；腸道組織中信號通路分子p38MAPK、ERK1/2和NF-κBp65的磷酸化水平顯著降低，而I-κBα表達量顯著上升（P<0.05）。5）與單純LPS刺激未經(jīng)乳酸桿菌灌胃小鼠相比，高粘附力乳酸桿菌 ZJ617連續(xù)灌胃一周的小

9、鼠接受 LPS刺激后，其腸道組織中炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和TLR受體TLR2、TLR4、TLR9的mRNA水平顯著升高，同時小鼠腸道組織中抗炎性細胞因子IL-10的mRNA水平顯著升高；腸道組織中信號通路分子I-κBα表達量顯著下降（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：由此可見，鼠李糖乳酸桿菌LGG主要通過調(diào)節(jié)小腸上皮細胞Toll樣受體mRNA水平，抑制細胞MAPK和NF-κB信號通路激活，降低LPS誘導的炎性細