大鼠心臟中神經(jīng)肽y的y1 受體樣免疫反應(yīng)物質(zhì)的定位

1、<p>　　大鼠心臟中神經(jīng)肽Y的Y1 受體樣免疫反應(yīng)物質(zhì)的定位</p><p>　　作者：鮑嵐　張平　程希平　張旭 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 心臟 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 心臟;大鼠;Y1 受體;神經(jīng)肽Y </p><p>　　摘 要:目的 為在細(xì)胞水平精確地確定神經(jīng)肽Y（NPY）的Y1 受體樣免疫反應(yīng)物質(zhì)（

2、-LI）在大鼠心臟中的分布. 方法 用免疫組織化學(xué)方法對Y1 受體-LI細(xì)胞進(jìn)行了檢測. 結(jié)果 ①一些心肌細(xì)胞含有Y1 受體-LI，可見清晰的Y1 受體免疫反應(yīng)性（-Ir）條紋，此類細(xì)胞在心臟呈斑點(diǎn)狀分布，接近外膜側(cè)和室間隔的內(nèi)膜側(cè)分布較多，Y1 受體-LI主要分布于心肌細(xì)胞膜、橫小管膜和小泡上;②心臟內(nèi)有Y1 受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元，此類細(xì)胞有較長的突起，呈離散分布，與Y1 受體-LI心肌細(xì)胞或血管相鄰，Y1 受體-LI神經(jīng)元的外

3、膜和胞質(zhì)內(nèi)有較強(qiáng)的Y </p><p>　　1 受體-LI，尤以其突起明顯. 結(jié)論 NPY對心臟作用的復(fù)雜性可能與Y1 受體在心臟中多種細(xì)胞的廣泛分布有關(guān). </p><p>　　Keywords:heart;rats;Y1 receptor;neuropeptide YAbstract:AIM To accurately localize neuropeptide Y（NPY）Y1 r

4、eceptor（-R）-like immunoreactivity（-LI）in rat hearts.METHODS Y1 -R immunoreactive（-Ir）cells were examined with immunohistochemistry.RESULTS Y 1 -R-LI was observed in some cardiomyocytes of rat hearts with a stripe-like pa

5、ttern in the cells.These cells were scattered in the heart，especially near the outer membrane of the heart and the inner membrane of interventricular septum.Y1 -R-LI was mainl</p><p>　　1 -R-LI was observed n

6、ear the plasmalemma and the cytoplasm of neurons，especially in their processes.CONCLUSION The complicated effects of NPY on the heart may be related to the extensive distribution of Y1 recep-tor in varied cells of the he

7、art. </p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　含神經(jīng)肽Y（NPY）的神經(jīng)纖維分布于整個心臟［1］ .通常情況下，NPY與去甲腎上腺素（NA）共存于交感神經(jīng)元，但大鼠心臟中約有半數(shù)的NPY神經(jīng)纖維不與NA共存，而存在于心內(nèi)神經(jīng)元中［2］ .根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，NPY對心臟的作用至少通過兩種以上的受體介導(dǎo)，即Y1 ，Y2 和Y3 等受體［

8、3］ .通過受體放射自顯影方法觀察到心臟有Y1 受體的結(jié)合點(diǎn)［4］ ，用分子原位雜交方法也觀察到人類心臟中有表達(dá)Y1 受體的mRNA［5］ .但由于已往的檢測方法對組織定位的精確性不夠，無法在細(xì)胞水平精確地確定受體的位置.本研究用針對Y1 受體C末端肽片段的一種純化的抗血清［6，7］ ，用免疫組織化學(xué)方法研究大鼠心肌細(xì)胞和心內(nèi)神經(jīng)元Y1 受體的分布. </p><p><b>　　1 材料和方法 <

9、;/b></p><p>　　1.1 免疫光鏡組織化學(xué)方法 SD大鼠（體質(zhì)量200～250g）10只（本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供），戊巴比妥鈉（50mg&#12539;kg-1 ，ip）麻醉，經(jīng)心臟灌注37℃生理鹽水50mL和含40g&#12539;L-1 多聚甲醛的0.1mol&#12539;L -1 磷酸緩沖液（PB）50mL，再灌注4℃同樣固定液250mL，取心臟，放入4℃同樣固定

10、液后固定1.5h，200g&#12539;L-1 蔗糖浸泡24h以上，用冰凍切片機(jī)（Leica，德國）切20μm的心臟矢狀和冠狀切片.根據(jù)免疫組織化學(xué)方法，將切片放入針對Y </p><p>　　1 受體C末端肽片段的一種純化的兔抗血清（1∶8000）［6-8］ 中，用生物素標(biāo)記的羊抗兔血清（1∶200）和Vector ABC盒（Vector實(shí)驗(yàn)室，美國）孵育，用葡萄糖氧化酶、二甲基聯(lián)苯胺（DAB）和硫酸

11、鎳胺加強(qiáng)法顯色，標(biāo)記物質(zhì)呈深藍(lán)色，經(jīng)干燥、透明和DPX封片.在Nikon Microphot-FX顯微鏡下觀察標(biāo)本，Leica圖像處理系統(tǒng)（Leica-Q570C，德國）取像，出照片. </p><p>　　1.2 免疫電鏡組織化學(xué)方法 SD大鼠4只，麻醉、灌注和后固定同上，固定液為含50mL&#12539;L -1 戊二醛和40g&#12539;L -1 多聚甲醛的PB.取心臟，切50～100

12、μm振動切片.免疫組織化學(xué)方法處理同上，進(jìn)行常規(guī)DAB反應(yīng)，標(biāo)記物質(zhì)呈棕色.在10g&#12539;L-1 鋨酸中處理30min，經(jīng)梯度乙醇和環(huán)氧丙烷脫水后，在Epon812中浸潤，做平板包埋，聚合后在光鏡下定位，取材，在LKBⅢ超薄切片機(jī)上切片，不做鉛鈾染色，在JEOL-1200電子顯微鏡下觀察，拍照，出照片. </p><p>　　用制備抗體用的合成的Y1 受體C末端多肽片段以1μmol&#1

13、2539;L-1 與Y1 受體抗體預(yù)吸收24h（4℃）后，做以上免疫組織化學(xué)反應(yīng)，以此檢驗(yàn)抗血清免疫標(biāo)記的特異性. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 心肌細(xì)胞 大鼠心臟內(nèi)一些心肌細(xì)胞可見中等強(qiáng)度的藍(lán)黑色著色，為Y1 受體-LI（Fig1），可見清晰的Y1 受體-Ir標(biāo)記條紋，為心肌細(xì)胞內(nèi)橫小管結(jié)構(gòu)，有的與心臟內(nèi)Y 受體-L

14、I血管相鄰（Fig2）.左右心房、左右心室、房間隔、室間隔和房室瓣膜上均有Y1 標(biāo)記-Ir心肌細(xì)胞，此類細(xì)胞在心臟呈散在的不均勻分布，近心外膜側(cè)分布較多（Fig3），尤以左心室最明顯，室間隔近心內(nèi)膜的兩側(cè)分布也較多.在電鏡下可以觀察到一些心肌細(xì)胞的外膜上有精細(xì)和間斷的Y1 受體-LI標(biāo)記，近胞質(zhì)處有顆粒樣的Y1 受體-LI標(biāo)記物，也可見正在內(nèi)吞的有Y1 受體-LI標(biāo)記的小泡（Fig4）.在橫小管兩側(cè)膜上有Y1 受體-LI標(biāo)記（Fig5）

15、，常在相鄰的數(shù)個橫小管中同時出現(xiàn)，也可間隔出現(xiàn). </p><p>　　2.2 神經(jīng)元 大鼠心臟內(nèi)有較強(qiáng)標(biāo)記的Y1 受體-Ir神經(jīng)元（Fig6，7），這些神經(jīng)元體積小，并有多個突起，有的突起較長，此類細(xì)胞在心臟內(nèi)呈離散分布，單個存在，常與Y1 受體-Ir心肌細(xì)胞相鄰（Fig6）.左右心房、左右心室、房間隔和室間隔上均有此類Y1 受體-Ir神經(jīng)元，但在竇房結(jié)和房室結(jié)周圍未見大量的Y1 受體-Ir神經(jīng)元.心內(nèi)神經(jīng)元

16、胞體的外膜有較深的點(diǎn)狀Y1 受體-LI標(biāo)記，其突起的外膜處也有斷續(xù)的 Y1 受體-LI標(biāo)記，較胞體外膜多（Fig8）.胞體的胞質(zhì)內(nèi)有一些與Y1 受體-LI標(biāo)記的外膜相臨的Y1 受體-Ir小泡，也有一些顆粒狀和塊狀的Y1 受體-LI，神經(jīng)元的胞核在胞體中占較大部分，有時在胞膜和胞核間的狹小空間內(nèi)充滿了Y1 受體-Ir結(jié)構(gòu).突起的胞質(zhì)內(nèi)有較強(qiáng)的Y1 受體-Ir結(jié)構(gòu)，有時充滿了一小段突起，有許多Y1 受體-Ir小泡，另有一些顆粒狀結(jié)構(gòu).這些含

17、Y1 受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元可以與周圍的心肌細(xì)胞相臨，在心肌細(xì)胞與之相臨面可見外膜有Y1 受體-LI（Fig8）;Y1 受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元也可與心內(nèi)血管相臨，有時與血管腔只有一層內(nèi)皮細(xì)胞之隔（Fig9）. </p><p>　　用經(jīng)預(yù)吸收后的抗血清孵育組織切片，并做免疫組織化學(xué)反應(yīng)后未見有以上描述的陽性結(jié)構(gòu). </p><p><b>　　3 討論 </b><

18、;/p><p>　　NPY受體與心臟的變時和變力作用有關(guān)［9］ .我們提供了Y1 受體存在于心肌細(xì)胞和心內(nèi)神經(jīng)元的直接形態(tài)學(xué)證據(jù).在通常情況下，Y1 受體-LI心肌細(xì)胞和心內(nèi)神經(jīng)元呈散在的不均勻分布，靠心肌外膜側(cè)較多，左右心房、左右心室、房間隔、室間隔和房室瓣膜上均有分布.Y1 受體在心臟的多種細(xì)胞和廣泛分布為NPY對大鼠心臟變時和變力作用的多樣性［9］ 提供了一定的依據(jù). </p><p>

19、　　許多以往的研究顯示心臟組織有大量的NPY免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維，心房多于心室［10］ .同時有研究表明心臟具有多種NPY受體，如受體放射自顯影配基結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示心室膜有NPY的結(jié)合位點(diǎn)，用選擇性的Y2 受體激動劑NPY（13-36）結(jié)合指示此為Y2 受體;又如在心室肌，其NPY受體對PYY和NPY的親合性存在差別，而到目前為止Y1 和Y2 受體對PYY和NPY幾乎具有同樣的親合性，因此認(rèn)為在心室肌的結(jié)合位點(diǎn)為Y3 受體［11］ .藥

20、理學(xué)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)心臟內(nèi)有多種NPY受體，大鼠心肌細(xì)胞至少存在兩種接后（postjunctional）NPY受體，Y1 可能介導(dǎo)NPY對心肌細(xì)胞的負(fù)性收縮反應(yīng)［12］ .本研究證實(shí)大鼠心肌細(xì)胞有Y1 受體，但呈散在分布，未見心房內(nèi)有許多Y1 受體-Ir的心肌細(xì)胞，似與心臟內(nèi)NPY神經(jīng)纖維的密集和區(qū)域密集分布不匹配，有可能這些心肌細(xì)胞表達(dá)其他類型的NPY受體.此外，Y1 受體-Ir心肌細(xì)胞散在分布于較多的Y1 受體陰性心肌細(xì)胞中，NPY

21、是如何通過具有Y1 受體的心肌細(xì)胞對整體心肌產(chǎn)生作用尚待進(jìn)一步研究. </p><p>　　圖1 －圖9 略 </p><p>　　在電鏡下可清晰地觀察到大鼠一些心肌細(xì)胞的外膜和橫小管膜上及胞質(zhì)中有Y1 受體-LI，且存在于小泡中.Y1 受體為G蛋白偶聯(lián)超家族受體，NPY作用于接后Y1 受體時，通過抑制性的G蛋白，可能對心肌產(chǎn)生負(fù)性肌力作用［9］ ，在這一過程中，均可引起細(xì)胞內(nèi)鈣

22、離子變化.通常情況下，心肌細(xì)胞經(jīng)橫小管將興奮傳向終池，使肌漿網(wǎng)膜上的鈣泵活動，肌漿內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生改變，從而引起心肌一系列變化［13］ .NPY可能通過作用于心肌外膜和橫小管膜上的Y1 受體，對心肌收縮力產(chǎn)生影響. </p><p>　　我們的研究表明，大鼠心臟有較強(qiáng)的Y1 受體-Ir神經(jīng)元，并具有較長的突起，可能為心內(nèi)神經(jīng)元，心內(nèi)神經(jīng)元主要為迷走神經(jīng)的節(jié)后神經(jīng)元，可單個存在.有研究報(bào)道心內(nèi)神經(jīng)元中有NPY反應(yīng)

23、陽性神經(jīng)元［14］ ，因此來自心內(nèi)神經(jīng)元自分泌或旁分泌的NPY對其自身有調(diào)節(jié)作用，也可對其周圍的心肌細(xì)胞產(chǎn)生作用，這也為Y1 受體可以是接前（prejunctional）受體提供了新的證據(jù).已有的研究發(fā)現(xiàn)大鼠心臟有一種小強(qiáng)熒光細(xì)胞位于心肌細(xì)胞之間，有的在有孔毛細(xì)血管周圍，可釋放兒茶酚胺或其他物質(zhì)到組織間隙或血管內(nèi)，以內(nèi)分泌和旁分泌的方式起局部調(diào)節(jié)作用［15］ .我們的研究發(fā)現(xiàn)Y1 受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元可與心內(nèi)血管相臨，特別是有時與血管

24、腔只有一層內(nèi)皮細(xì)胞之隔，因此Y1 受體-LI的心內(nèi)神經(jīng)元也可能是此小強(qiáng)熒光細(xì)胞，NPY通過對接前Y1 受體的作用，除對乙酰膽堿的釋放起調(diào)節(jié)作用外，對兒茶酚胺或其他物質(zhì)的釋放也起調(diào)節(jié)作用. </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Wharton J，Gulbenkian S.Peptides in the mammalian ca

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