小麥組蛋白變體的克隆及小麥葉綠體蛋白組比較.pdf

1、鹽、旱等逆境脅迫是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素。研究作物耐逆機理、分離耐逆基因、培育耐逆作物新品種是應(yīng)對逆境脅迫的有效途徑。植物非生物脅迫應(yīng)答是由眾多基因組成的信號網(wǎng)絡(luò)在遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)水平進行協(xié)同調(diào)控，系統(tǒng)改變?nèi)~綠體及其他細胞器的生理活性而實現(xiàn)的。本實驗以小麥漸滲系耐鹽抗旱品種山融3號(SR3)及其親本普通小麥濟南177(JN177)為材料，一方面分析了表觀遺傳調(diào)控相關(guān)的組蛋白變體與小麥鹽脅迫應(yīng)答的關(guān)系，另一方面進行了葉綠體蛋白質(zhì)組分析，進

2、一步認識SR3的耐逆能力與葉綠體的關(guān)系。
　　 一、SR3和JN177組蛋白變體基因的克隆和耐逆功能分析
　　 組蛋白是一類進化上高度保守的蛋白，是構(gòu)成核小體的主要成分。組蛋白變體是特殊狀態(tài)下染色體組裝所需的組蛋白類型，一般通過替換常規(guī)組蛋白導(dǎo)致染色體重塑進入核小體，能在表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗室前期轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，一系列注釋為組蛋白變體的探針在鹽脅迫下表達發(fā)生明顯變化，而且部分探針的表達量在SR3和JN17

3、7間存在顯著差異，暗示組蛋白變體在植物耐逆應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。
　　 本實驗根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，克隆了8個組蛋白變體基因，包括H2A變體TaH2A-1～4和TaH2A.Z-1、H3變體TaH3-1～2、H4變體TaH4-1。這些基因的cDNA和基因組序列在SR3和JN177間均分別相同，其中TaH2A-4和TaH3-2含有1個內(nèi)含子。它們的氨基酸序列含有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)和核定位信號，亞細胞定位分析顯示這些變體定位于細胞核。RT

4、-PCR分析發(fā)現(xiàn)，這些基因均具有鹽脅迫響應(yīng)表達特征，并且有些只在根中表達。
　　 為了驗證其生物學(xué)功能，我們將五個變體基因轉(zhuǎn)化到擬南芥，其中TaH2A-2、TaH2A-3和TaH2A.Z-1能正常表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因的過表達系和野生型在整個生長周期中均沒有明顯差異。在NaCl、H2O2、甘露醇和各種激素處理下，TaH2A-2和TaH2A.Z-1過表達株系與野生型的萌發(fā)率、植株葉片大小和根長均沒有顯著性差異。NaCl、NAA、

5、ACC、GA3處理下，TaH2A-3過表達株系與對照的萌發(fā)率、植株葉片大小和根長也沒有顯著性差異。但與野生型相比，TaH2A-3過表達株系的抗旱能力增強，抗氧化能力降低，甘露醇處理下側(cè)根數(shù)目減少，ABA處理下萌發(fā)延遲。這些結(jié)果顯示，不同組蛋白變體在抗逆中的作用存在顯著差異，而這種差異可能源于它們在染色體重塑中的作用機制差異，TaH2A-2和TaH2A.Z-1需要通過核小體組裝協(xié)同作用因子才能被招募到染色體上而TaH2A-3則不需要，或者

6、TaH2A-2和TaH2A.Z-1被招募到染色體上發(fā)揮與擬南芥同源蛋白相似的功能而TaH2A-3則發(fā)揮不一樣的功能。
　　 二、SR3和JN177葉綠體蛋白質(zhì)組分析
　　 葉綠體是植物細胞中進行光合作用的場所，是植物進行自養(yǎng)生存的關(guān)鍵。實驗室前期蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SR3的旺盛生長和抗性與葉綠體同化能力相關(guān)。為了進一步認識這一關(guān)系，本試驗開展了葉綠體蛋白組學(xué)分析。我們改進了小麥葉綠體提取方法，獲得了純度較高的葉綠體。通過

7、雙向電泳，得到了28個差異表達的蛋白點，其中正常條件下SR3和JN77間差異的18個（JN177中表達量高的8個，表達量低的10個），NaCl脅迫下兩者間差異的2個，正常和NaCl脅迫間差異的8個。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜和MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定了21個差異蛋白點，主要包括光合作用相關(guān)蛋白、光合系統(tǒng)穩(wěn)定相關(guān)蛋白及蛋白質(zhì)合成/轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白。其中，卡爾文循環(huán)中關(guān)鍵酶磷酸核酮糖激酶和核酮糖二磷酸羧化酶多個亞基的含量在SR3和JN1