小麥種子貯藏蛋白鑒定及醇溶蛋白編碼基因的分子克隆.pdf

1、麥醇溶蛋白作為小麥胚乳中重要的貯藏蛋白，其組成和含量對(duì)小麥面粉的烘烤品質(zhì)具有重要影響。醇溶蛋白的高效分離鑒定和編碼基因的定向克隆，是研究麥醇溶蛋白及其與品質(zhì)關(guān)系的可靠途徑，并為基因工程改良小麥品質(zhì)提供新的基因資源，從而推動(dòng)小麥品質(zhì)改良工作。 小麥貯藏蛋白的研究是伴隨著分離技術(shù)的發(fā)展而不斷深入的。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展以及一些先進(jìn)的分離手段的出現(xiàn)，大大促進(jìn)了對(duì)小麥種子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究，其中反相高效液相色譜(RP-HPLC)和

2、生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為我們提供了貯藏蛋白快速分離與定量以及精確確定其分子量的有效方法。本研究的主要目的旨在建立貯藏蛋白高效分離鑒定的反相高效液相色譜和生物質(zhì)譜方法，同時(shí)，利用AS-PCR方法分離克隆醇溶蛋白編碼基因，主要研究結(jié)果如下： ●貯藏蛋白R(shí)P-HPLC分離鑒定本研究系統(tǒng)分析了柱溫、洗脫梯度、樣品量、提取時(shí)間和上樣體積等因素對(duì)RP-HPLC分離分析的影響，以反相色譜柱(ZORBAX300SB-C18StableBandAna

3、lytical4.6x250mm，5-Micron)和Aglient1100高效液相色譜系統(tǒng)，建立了適合小麥貯藏蛋白分析的反相高效液相色譜技術(shù)體系，主要參數(shù)包括：柱溫50℃、流速1.00ml/min、進(jìn)樣量5μl、洗脫梯度55分鐘內(nèi)乙腈濃度由21％升到48％(v/v)。分析發(fā)現(xiàn)HMW-GS中1Ax1、1Bx6、1Bx7、1Bx13、1Bx14、1Bx17、1Dx2、1Dx5、1By8、1By18、1Dy10、1Dy12等均能用該體系進(jìn)行

4、較好的分離，而1Dx2和1By15、1Dx5和1By15、1Dx2和1By20等亞基較難分離開，1Dx5和1By9、1Dx5和1By18、1Dx2和1By16等亞基用該體系很難分離鑒定。此外，該方法可對(duì)優(yōu)質(zhì)醇溶蛋白γ45亞基進(jìn)行有效的分離和鑒定。本研究結(jié)果表明，RP-HPLC可作為小麥品質(zhì)改良中雜種早期世代優(yōu)質(zhì)亞基鑒定篩選的可靠方法。 ●醇溶蛋白MALDI-TOF-MS鑒定本研究對(duì)小麥醇溶蛋白基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(M

5、ALDI-TOF-MS)鑒定技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，初步摸索出一套樣品用量少、操作簡(jiǎn)便快速、適合高通量分析的技術(shù)體系。分析結(jié)果表明，15-20mg小麥種子樣品足夠進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，研磨后用70％乙醇抽提15分鐘后離心，上清即可用于質(zhì)譜檢測(cè)。圖譜顯示，不同醇溶蛋白組分分辨度較好，圖譜清晰，分子量多集中在3000-5000kD之間。ω-醇溶蛋白分子量較大，且含量較少，零散分布在4500-8000kD之間。 ●醇溶蛋白編碼基因分子克隆利用ω-醇溶

6、蛋白基因引物F和R1，采用AS-PCR基因克隆方法從普通小麥品種綿麥26與濟(jì)麥19中擴(kuò)增得到特異條帶，進(jìn)行DNA測(cè)序和序列分析后發(fā)現(xiàn)獲得的DNA序列含有典型ω-醇溶蛋白基因特征，證實(shí)它們都為ω-醇溶蛋白編碼基因。通過基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同基因之間的差異主要是由單個(gè)堿基的替換、缺失和插入造成的。ω-醇溶蛋白重復(fù)區(qū)中典型的重復(fù)單元(repeatunit)是PFPQ1-2(PQQ)1-2。分離得到的2個(gè)ω醇溶蛋白編碼基因都含有2個(gè)終止密碼子，

7、因此都是沉默基因。 從Genebank中釣取HMW-GS、LMW-GS、醇溶蛋白及大麥醇溶蛋白的編碼基因，利用生物軟件DNAMAN對(duì)釣取的26個(gè)基因的DNA序列進(jìn)行聚類分析，可以進(jìn)一步了解它們之間的分子進(jìn)化關(guān)系。編碼ω-醇溶蛋白的基因聚類在一個(gè)亞組，相似系數(shù)為76％，表明它們具有較高的同源性。從綿麥26與濟(jì)麥177中克隆的2個(gè)ω-醇溶蛋白基因由于都來(lái)源于面包小麥品種，同源性很高，相似系數(shù)高達(dá)99％，它們與大麥醇溶蛋白C型亞基之間