青稞B組醇溶蛋白基因與上游調(diào)控區(qū)的克隆及基因表達.pdf

1、高等植物種子胚乳貯藏蛋白是種子發(fā)芽時的主要氮源，也是人類和動物食用植物蛋白的主要來源。大麥種子胚乳貯藏蛋白主要是醇溶蛋白(hordeins)，占大麥胚乳總蛋白的50-60％。根據(jù)大麥醇溶蛋白的大小和組成特點，大麥醇溶蛋白被劃分為三種類型：富硫蛋白亞類(B，γ-hordeins)、貧硫蛋白亞類(C-hordeins)以及高分子量蛋白亞類(D-hordeins)。B組和C組醇溶蛋白是大麥胚乳的兩類主要貯藏蛋白，它們分別占大麥總醇溶蛋白成分的

2、70-80％和10-12％。遺傳分析表明，大麥B、C、D和γ-組醇溶蛋白分別是由位于大麥第五染色體1H(5)上的Hor2、Hor1、Hor3和Hor5位點編碼。Hor2位點編碼大量分子量相同但組成不同的B組醇溶蛋白(B-hordein)。B-hordein的種類、數(shù)量和分布是影響大麥釀造、食用及飼養(yǎng)品質(zhì)的重要因素之一。為深入了解B-hordein基因家族的結(jié)構(gòu)和染色體組織，探明Hor2位點基因表達的發(fā)育調(diào)控機制，最終達到改良禾谷類作物籽

3、粒品質(zhì)的目的，本研究以青藏高原青稞為材料，采用同源克隆法，分別克隆B-hordein基因和啟動子，通過原核生物表達驗證B-hordein基因功能，并利用實時定量PCR探索B-hordein基因表達時空關(guān)系，取得如下研究結(jié)果：
　　 1.以具有特殊B組醇溶蛋白亞基組成的9份青藏高原青稞為材料，根據(jù)GenBank中三個B-hordein基因序列(GenBank No.X03103，X53690和X53691)設(shè)計一對引物，通過PCR

4、擴增，獲得23個B-hordein基因克隆并對其進行了序列分析。核苷酸序列分析表明，所有克隆均包含完整的開放閱讀框。有11個克隆都存在一個框內(nèi)終止密碼子，推測這11個克隆可能是假基因。推測的氨基酸序列分析表明，所有大麥B-hordein具有相似的蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)，均包括一個高度保守的信號肽、中間重復(fù)區(qū)以及C-端結(jié)構(gòu)域。不同大麥種重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)基元的數(shù)目有較大差異。青稞材料Z07-2和Z26的B-hordeins僅具有12個重復(fù)基元結(jié)構(gòu)，更接

5、近于野生大麥。這些重復(fù)基元數(shù)目的差異導(dǎo)致了重復(fù)區(qū)序列長度和結(jié)構(gòu)的變異。這種現(xiàn)象極可能是由于醇溶谷蛋白基因在進化過程中染色體的不平衡交換或復(fù)制滑動所造成的。對所克隆基因和禾本科代表性醇溶谷蛋白基因進行聚類分析，結(jié)果表明所有來自栽培大麥的B-hordeins聚類成一個亞家族，來自野生大麥的B-hordeins以及普通小麥的LMW-GS聚類成另外一個亞家族，表明這兩個亞家族的成員存在顯著差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)B-hordein基因推測的C-末端

6、序列具有一些有規(guī)律的特征：即具有相同C-末端序列的B-hordein基因在系統(tǒng)發(fā)生樹中聚類為同一個亞組(除BXQ053，BZ09-1，BZ26-5分別單獨聚為一類外)。這個特征將有助于我們對所有B組醇溶蛋白基因家族成員進行分類，避免了在SDS-PAGE電泳圖譜上僅依靠大小分類的局限性。
　　 2.根據(jù)上述克隆的青稞B-hordein基因的5'端序列設(shè)計三條基因特異的反向引物，以青稞Z09和Z26的基因組DNA為模板，采用SON-

7、PCR和TAIL-PCR技術(shù)分離克隆出8個B-hordein基因的上游調(diào)控序列(命名為Z09P和Z26P)。序列分析表明，推測的TATA box位于-80 bp，CAAT-like box位于-140 bp處。此外，Z09P和Z26P中有六個序列在-300 bp處均存在一個由高度保守的EM基序和類GCN4基序構(gòu)成的胚乳盒(Endosperm Box，EB)，在約-560 bp處存在一個胚乳盒類似結(jié)構(gòu)。而Z09P-2和Z26P-3不存在保

8、守的胚乳盒或其類似結(jié)構(gòu)，預(yù)示著這兩個啟動子所調(diào)控的基因表達可能受不同類型反式作用因子的調(diào)節(jié)，推測該啟動子對基因的表達調(diào)控具有多樣性。
　　 3.將B-hordein基因的開放閱讀框定向克隆到表達載體pET-30a中，將其導(dǎo)入大腸桿菌表達菌株BL21中進行外源基因的誘導(dǎo)表達以驗證所克隆基因的功能。結(jié)果表明僅含重組子pET-BZ07-2和pET-BZ26-5的BL21細菌有目的表達蛋白產(chǎn)生。在誘導(dǎo)3 h時的蛋白表達量最高；3 mM

9、IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達量要高于1 mM IPTG誘導(dǎo)的表達量。這為分離純化B-hordein蛋白以及進一步研究其對大麥籽粒品質(zhì)的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 4.根據(jù)從青稞Z09和Z26中分離克隆的B-hordein基因序列設(shè)計一對基因特異的引物，同時，選擇大麥α-微管蛋白基因(GenBank no.U40042)為看家基因并設(shè)計特異引物，利用實時熒光定量PCR檢測了青稞籽粒4個胚乳發(fā)育時間段的B-hordein基因表達，熒光定量結(jié)果顯

10、示：兩份材料中B-hordein基因的表達量均隨發(fā)育過程的進行而逐漸升高。Z09中B-hordein基因在開花后7天開始轉(zhuǎn)錄，而Z26開花4天后就有低水平B-hordein的表達，這表明Z26中B-hordein基因可能比Z09表達的較早或者Z09中B-hordein基因表達水平較低以致于不能被檢測到。此外，在4個不同的胚乳發(fā)育時期中，Z26中B-hordein基因的表達量均高于Z09材料。在開花12天到18天的過程中，Z09和Z26中