小麥及其近緣種α-醇溶蛋白的鑒定與編碼基因的分子克隆.pdf

1、醇溶蛋白作為小麥胚乳中重要的貯藏蛋白，其組成和含量對小麥面粉的烘烤品質(zhì)具有重要影響。普通小麥(Triticum aestivum L，2n=6x=42，AABBDD)中的優(yōu)質(zhì)品種是研究小麥醇溶蛋白與優(yōu)良品質(zhì)關(guān)系的重要材料。粗山羊草(Aegilops tauschii，2n=2x=14，DD)是小麥D基因組的供體，具有豐富的貯藏蛋白等位變異，是小麥品質(zhì)改良的重要基因資源。本研究以普通小麥優(yōu)質(zhì)品種和粗山羊草為材料，利用反相高效液相色譜(RP

2、-HPLC)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對α-醇溶蛋白進行分離和鑒定，并利用PCR方法對其編碼基因進行分子克隆，進而分析這些α-醇溶蛋白基因的分子結(jié)構(gòu)特點及醇溶蛋白基因家族的同源性，同時對部分α-醇溶蛋白編碼基因進行原核表達(dá)研究。主要研究結(jié)果如下： 1.粗山羊草和普通小麥α-醇溶蛋白的分離與鑒定利用RP-HPLC對粗山羊草T15、T43、T26和普通小麥優(yōu)質(zhì)品種中優(yōu)9507、藁城8901的α-醇

3、溶蛋白組分進行初步的分離鑒定。通過MALDI-TOF-MS對鑒定結(jié)果進行進一步的驗證，并獲得各組分的精確分子量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在粗山羊草中α-醇溶蛋白組分較少，T1 5中約為4個、T43中約為3個、T26中約為6個；而普通小麥中α-醇溶蛋白組分較為復(fù)雜，而且其分子量很接近，中優(yōu)9507和藁城890l中α-醇溶蛋白組分都在20個左右，表明六倍體普通小麥α-醇溶蛋白的多態(tài)性較高。 2.α-醇溶蛋白編碼基因的分子克隆與序列比較分析利用一對

4、特異的α-醇溶蛋白基因引物，以粗山羊草T15、T43、T26的基因組DNA和普通小麥中優(yōu)9507、藁城8901的cDNA為模板分別進行AS-PCR擴增，均獲得了約850bp左右的單一條帶，分別回收并克隆到pGEM-T Easy載體上，DNA測序后得到19個α-醇溶蛋白基因，其中T15和T43各1個、T26 2個、中優(yōu)9507 8個、藁城8901 7個。這些基因命名后已登陸GenBank，編號為EF561270-EF561288。

5、 基因序列分析表明，所得序列均為以ATG起始密碼子開始、以TGA密碼子結(jié)束的完整的α-醇溶蛋白編碼基因，推導(dǎo)的氨基酸序列具有典型的α-醇溶蛋白的序列結(jié)構(gòu)特征，由20個氨基酸的信號肽、N端重復(fù)區(qū)、多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)、特征區(qū)Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)和特征區(qū)Ⅱ六部分組成，且部分基因推導(dǎo)出的分子量與質(zhì)譜精確測定的分子量很接近，我們可以初步認(rèn)為這些基因是質(zhì)譜鑒定的蛋白的編碼基因。氨基酸序列比對分析顯示：這些基因與已知α-醇溶蛋白基因有很高的一致性，但也

6、具有獨有的特征。在 1Gli-At3和Gli-Z7的特征區(qū)Ⅱ前端發(fā)現(xiàn)了一個額外的半胱氨酸。半胱氨酸的增加有助于二硫鍵的形成，從而對面團特性產(chǎn)生影響。根據(jù)推導(dǎo)氨基酸序列所具有的四種T細(xì)胞抗原表位、多聚谷氨酰胺重復(fù)區(qū)的平均長度及同源性分析，我們對普通小麥中得到的基因進行了初步的染色體定位，將Gli-G2和Gli-Z3定位于6A染色體上；Gli-Gli、Gli-G6、Gli-Z2、Gli-Z4和Gli-Z8定位于6B染色體上；Gli-G3、G

7、li-G4、Gli-G5、Gli-G7、Gli-Z1、Gli-Z5、Gli-Z7定位于6D染色體上。 3.克隆基因的原核表達(dá)設(shè)計不擴增信號肽的表達(dá)引物，分別擴增T15、T43、T26、中優(yōu)9507和藁城8901中的一個基因，擴增片斷克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-2上，轉(zhuǎn)化到E. coli表達(dá)菌株BL-21(DE3) plysS。IPTG誘導(dǎo)后，收集菌液提取蛋白，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明以上5個α-醇溶蛋白編碼基因均在