馬卡小麥種子蛋白及基因研究.pdf

1、種質(zhì)資源是作物新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)，將近緣屬種優(yōu)異基因資源轉(zhuǎn)入普通小麥一直受到育種工作者關(guān)注。馬卡小麥作為小麥族的種質(zhì)資源之一，收集并研究其各方面品質(zhì)特性對(duì)我國(guó)小麥的品質(zhì)改良有著一定的應(yīng)用價(jià)值。馬卡小麥含有優(yōu)質(zhì)面包等位基因，與普通小麥雜交能正常結(jié)實(shí)并產(chǎn)生生育能力正常的雜種后代，轉(zhuǎn)移基因容易。本文對(duì)來(lái)自格魯吉亞、匈牙利、前蘇聯(lián)、英國(guó)、美國(guó)、瑞士和瑞典等國(guó)家的29份馬卡小麥醇溶蛋白和高分子量谷蛋白的遺傳變異進(jìn)行檢測(cè)，以期為進(jìn)一步發(fā)掘和利用馬

2、卡小麥特異基因資源提供理論依據(jù)。并根據(jù)醇溶蛋白和LMW-Glutenin基因的N-端和C-端保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR克隆的方法，對(duì)2份馬卡小麥的醇溶蛋白基因和LMW-GS進(jìn)行深入分析，既了解馬卡小麥基因序列特征特性，同時(shí)也可發(fā)掘其中的優(yōu)異新基因，以期為小麥品質(zhì)改良提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 抗病基因的研究一直是小麥抗病蟲(chóng)害研究的熱點(diǎn)，目前己有多個(gè)抗病基因從其它小麥轉(zhuǎn)入普通小麥中。但關(guān)于馬卡小麥抗蟲(chóng)基因的研究和利用目前

3、國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，將α-淀粉酶抑制因子用于植物轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)，安全性好，更易于人們接受。本研究的目的就是對(duì)馬卡小麥α-淀粉酶抑制因子CM16基因進(jìn)行分離克隆與序列分析，為篩選優(yōu)異抗蟲(chóng)基因提供基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容如下：
　　 一、種子貯藏蛋白A-PAGE和SDS-PAGE分析馬卡小麥?zhǔn)橇扼w(2n=6x=42,AABBDD)栽培小麥，與普通小麥雜交能正常結(jié)實(shí)并產(chǎn)生有生育能力的雜種后代，確屬普通小麥遺傳改良的重要基因資源。本文對(duì)不同地理

4、來(lái)源的馬卡小麥種子貯藏蛋白進(jìn)行了檢測(cè)與分析，主要結(jié)果如下:采用APAGE法檢測(cè)到馬卡小麥29份供試材料醇溶蛋白位點(diǎn)變異豐富。共有28種帶型和49條譜帶，每份材料可電泳分離出19-34條帶，平均25條。材料間遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.29-0.95，平均值為0.61，表明馬卡小麥具有較豐富的遺傳多樣性。在0.58水平上明顯聚為3類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果與材料來(lái)源地沒(méi)有必然聯(lián)系。同時(shí)推測(cè)來(lái)自格魯吉亞的材料在醇溶蛋白等位變異上可能存在兩種主要類(lèi)型。

5、>　　 利用SDS-PAGE法分析馬卡小麥高分子谷蛋白亞基(HMW-GS)組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其HMW-GS存在較豐富的亞基變異，共檢測(cè)到9種亞基類(lèi)型和9種亞基組合.其中，GluA1位點(diǎn)上null亞基出現(xiàn)頻率最高(達(dá)82.8％)。Glu-B1位點(diǎn)上7+8為優(yōu)勢(shì)亞基(占53.3％),7+9亞基出現(xiàn)頻率也相對(duì)較高(23.3％)。Glu-D1位點(diǎn)上優(yōu)勢(shì)亞基為2+12(占82.8％)。供試材料品質(zhì)評(píng)分變幅為}-8分，平均為6.2分。更為重要的是，發(fā)

6、現(xiàn)4份材料同時(shí)具有7+8和5+10優(yōu)質(zhì)亞基，可供普通小麥品質(zhì)育種利用。
　　 二、醇溶蛋白基因的分子克隆和序列分析根據(jù)小麥族己知α-和γ-醇溶蛋白基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，對(duì)馬卡小麥進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得了2個(gè)α-醇溶蛋白基因Gli-Mα1，Gli-Mα2。Genbank登錄號(hào)分別為FJ595934和FJ595935;2個(gè)γ-醇溶蛋白基因Gli-Mr1，Gli-Mr2，Genbank登錄號(hào)分別為FJ595937和FJ595936，因

7、在編碼區(qū)內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了提前終止密碼子，故推測(cè)其都為假基因。馬卡小麥的2個(gè)α醇溶蛋白基因與來(lái)源于小麥屬普通小麥、烏拉爾圖小麥、野生種二粒小麥等的相應(yīng)基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有著較高的相似性，同時(shí)也存在一定的差異，這些差異主要來(lái)源于氨基酸殘基以及重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)單元的替換、缺失和插入。一致性統(tǒng)計(jì)表明兩個(gè)α-醇溶基因同其它物種相應(yīng)基因的一致性在68.61％-96.46％范圍內(nèi)變化，兩個(gè)γ-醇溶蛋白基因與來(lái)源于小麥屬不同品種相應(yīng)基因之間同樣具有較高

8、的相似性，其一致性在77.71％-94.79％范圍內(nèi)變化。保守區(qū)進(jìn)化分析表明，兩個(gè)α-醇溶蛋白各自聚為一類(lèi)，Gli-Mα1與來(lái)源于普通小麥的醇溶的α醇溶蛋白親緣關(guān)系最近，而Gli-Mα2則與來(lái)源于Ⅴ染色體組的簇毛麥Dasypyrumbreviaristatum的α醇溶蛋白單獨(dú)聚為一類(lèi);兩個(gè)γ-醇溶蛋白同樣各自聚為一類(lèi)，與來(lái)源于T.turgidumsubsp.dicoccoides的FJ006564的親緣關(guān)系最近，其次為Aeg,tausc

9、hii。Gli-Mr2與來(lái)自普通小麥品種的FJ006606的γ-醇溶蛋白親緣關(guān)系最近。
　　 三、LMW-GS基因的分子克隆和序列分析利用己知LMW-GS基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物對(duì)2份馬卡小麥基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功克隆了2個(gè)LMW-GS基因Glu-LMl和Glu-LM2,Genbank序列號(hào)依次為FJ606796和FJ5995942。同小麥族其它LMW-GS基因進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，其5'側(cè)翼序列和氨基酸序列同其它亞基存在較高的

10、一致性，同樣具備LMW-GS的典型特征，同時(shí)也存在著一定的結(jié)構(gòu)上的差異，這些差異主要來(lái)源與氨基酸殘基的替換以及重復(fù)區(qū)結(jié)構(gòu)單元的缺失或插入。在Glu-LMl基因序列側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)順式作用元件EM(5'-TGTAAGT-3')。另外在2個(gè)基因種均出現(xiàn)2個(gè)TATAbox,Glu-LM1有3個(gè)3個(gè)CAATbox和2個(gè)AGGAbox，而Glu-LM2則有2個(gè)CAATbox和1個(gè)AGGAboxoGlu-LM1推導(dǎo)的氨基酸序列由20個(gè)氨基酸殘基組成的

11、信號(hào)肽，15個(gè)氨基酸殘基組成的N末端，一個(gè)由69個(gè)堿基組成的重復(fù)區(qū)和由172個(gè)氨基酸殘基組成的C端保守區(qū)。Glu-LM2的提前終止密碼子出現(xiàn)在重復(fù)區(qū)和CterⅡ區(qū)域，推測(cè)其為假基因。分子進(jìn)化分析表明，馬卡小麥的Glu-LMl和與來(lái)源于小麥族的A和D染色體族的Aegilopstauschii和T.aestivum聚為一類(lèi)。Glu-LM2與T.durum的親緣關(guān)系較近。
　　 四、CM16基因的分子克隆和序列分析馬卡小麥?zhǔn)瞧胀ㄐ←湼?/p>