伏馬菌素B-,1-人工抗原制備及其蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)方法的建立.pdf

1、伏馬菌素（FB1）是一族主要由幾種真菌產(chǎn)生的真菌毒素，廣泛存在并污染各種農(nóng)產(chǎn)品及谷物飼料，尤其以玉米及其制品中含量最大，對(duì)人類和動(dòng)物的危害較大，其毒性主要有急性毒性、亞急性毒性、神經(jīng)毒性、致癌性等。
　　 由于FB1的危害嚴(yán)重，每年因其造成的損失引起了全世界的普遍重視和關(guān)注。常見的檢測(cè)FB1的方法有：薄層層析法（TLC），高效液相法（HPLC）、氣相色譜法（GC），氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）等。
　　 蛋白質(zhì)芯片

2、是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新方法，它是在基因芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其原理是：抗原抗體都是蛋白質(zhì)，利用芯片點(diǎn)樣儀把能和抗體特異性結(jié)合的抗原高密度地固定到玻片或其他載體上，將待測(cè)樣品和特異性抗體混合加入到芯片表面的抗原上，再加入熒光二抗染料，通過洗脫把非特異性結(jié)合的蛋白洗掉，利用間接競(jìng)爭(zhēng)原理，當(dāng)檢測(cè)物含量高時(shí)，和抗原特異反應(yīng)的抗體就少（熒光二抗也少），反之抗體就多（熒光二抗也多），再利用芯片掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，利用軟件分析熒光信

3、號(hào)及信噪比，測(cè)定檢測(cè)物的含量；與傳統(tǒng)的研究方法相比具有微型化、集成化、高通量化、靈敏度高、所需樣品極少等優(yōu)點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)制備了人工抗原FB1-OVA，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定和濃度測(cè)定，為FB1蛋白質(zhì)芯片的制備提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)：利用間接競(jìng)爭(zhēng)的檢測(cè)原理，以熒光信號(hào)強(qiáng)度和信噪比對(duì)FB1蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容和方法如下：
　　 1、利用戊二醛（GA）一步法將FB1偶聯(lián)到載體蛋白-卵清蛋白（OVA）上。偶聯(lián)后的抗原（FB1-

4、OVA）通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定證明偶聯(lián)成功，測(cè)定其濃度為1.08mg·mol-1。
　　 2、在蛋白質(zhì)芯片的制備時(shí)，利用芯片點(diǎn)樣儀在醛基化玻片上先點(diǎn)上制備的人工抗原FB1-OVA（點(diǎn)樣環(huán)境：25℃，75％濕度），經(jīng)過固定、封閉、加上已經(jīng)制備好的的FB1抗體、加羊抗鼠IgG-CY3二抗等步驟，并用激光共聚焦掃描儀在激發(fā)波長(zhǎng)553nm讀取熒光信號(hào)，采用GenePixpro6.0對(duì)采集圖象進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從熒光信