甘草細胞空泡化的成因及調(diào)控策略研究.pdf

1、甘草為多年生草本植物,又稱美草,甜草根等,素有“十方九草”、“國老”、“百草之王”的美稱,能清熱解毒,潤肺止咳,調(diào)和諸藥性。但目前野生甘草資源短缺,故可通過細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)其藥效成分的方式來解決此問題。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)甘草細胞懸浮培養(yǎng)體系中存在兩種形態(tài)的細胞,一種為顆粒性細胞,一種為空泡化細胞?？张莼毎狞S酮含量僅為顆粒狀細胞的一半,黃酮產(chǎn)量大幅下降,在發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)時尤其突出,因此非常有必要控制空泡化甘草細胞的形成。本文主要

2、研究了空泡化細胞的特征及形成過程,分析了其形成原因,并初步建立了調(diào)控策略,研究結(jié)果如下:
　　(1)建立了甘草細胞培養(yǎng)的懸浮體系。甘草細胞生長曲線呈“S”型,最大細胞生物量、黃酮產(chǎn)量和查爾酮A產(chǎn)量、PAL酶活分別可達21.24 g L-1、67.5 mg L-1、7.9 mg L-1、5.91 U g-1 DW min-1。在細胞懸浮培養(yǎng)的第6天,細胞培養(yǎng)體系中會出現(xiàn)空泡化細胞?？张莼毎菑木奂男〖毎麍F上脫落下來的細胞,鏡檢時

3、呈現(xiàn)長條狀不規(guī)則性和空泡化等形態(tài)特征,其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量大幅下降,不利于細胞大規(guī)模培養(yǎng)。
　　(2)比較了正常顆粒狀甘草細胞和空泡化的甘草細胞的顯微結(jié)構(gòu),闡明了空泡化細胞的形成過程?？张莼毎杀慌_盼藍和PI染料染色。被PI染色時,發(fā)出較強的熒光,說明空泡化細胞的膜通透性增強,但是細胞膜沒有破碎,胞外也未檢測到內(nèi)容物外溢。電鏡結(jié)果顯示,正常顆粒狀細胞的細胞膜比較致密,線粒體飽滿且細胞核以及核仁完整。培養(yǎng)末期的空泡化細胞的細胞壁逐漸

4、疏松,線粒體發(fā)生了空泡化,核仁和染色質(zhì)固縮,出現(xiàn)核膜逐漸不完整等細胞凋亡特征。
　　(3)研究了細胞培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體系空泡化細胞出現(xiàn)前后微環(huán)境變化,分析了導致細胞空泡化的原因?？赡苁俏h(huán)境體系中溶氧和滲透壓在第6天的快速下降導致細胞內(nèi)線粒體受損,膜通透性發(fā)生改變,最終導致細胞發(fā)生凋亡。
　　(4)初步研究了甘草細胞空泡化的調(diào)控策略。通過向培養(yǎng)體系增加溶氧、改變培養(yǎng)基的滲透壓以及不添加激素2,4-D等方式,均能緩解細胞空泡化現(xiàn)