甘草細(xì)胞空泡化的成因及調(diào)控策略研究.pdf

1、甘草為多年生草本植物,又稱美草,甜草根等,素有“十方九草”、“國(guó)老”、“百草之王”的美稱,能清熱解毒,潤(rùn)肺止咳,調(diào)和諸藥性。但目前野生甘草資源短缺,故可通過(guò)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)其藥效成分的方式來(lái)解決此問(wèn)題。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中存在兩種形態(tài)的細(xì)胞,一種為顆粒性細(xì)胞,一種為空泡化細(xì)胞?？张莼?xì)胞的黃酮含量?jī)H為顆粒狀細(xì)胞的一半,黃酮產(chǎn)量大幅下降,在發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)時(shí)尤其突出,因此非常有必要控制空泡化甘草細(xì)胞的形成。本文主要

2、研究了空泡化細(xì)胞的特征及形成過(guò)程,分析了其形成原因,并初步建立了調(diào)控策略,研究結(jié)果如下:
　　(1)建立了甘草細(xì)胞培養(yǎng)的懸浮體系。甘草細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型,最大細(xì)胞生物量、黃酮產(chǎn)量和查爾酮A產(chǎn)量、PAL酶活分別可達(dá)21.24 g L-1、67.5 mg L-1、7.9 mg L-1、5.91 U g-1 DW min-1。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的第6天,細(xì)胞培養(yǎng)體系中會(huì)出現(xiàn)空泡化細(xì)胞?？张莼?xì)胞是從聚集的小細(xì)胞團(tuán)上脫落下來(lái)的細(xì)胞,鏡檢時(shí)

3、呈現(xiàn)長(zhǎng)條狀不規(guī)則性和空泡化等形態(tài)特征,其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量大幅下降,不利于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。
　　(2)比較了正常顆粒狀甘草細(xì)胞和空泡化的甘草細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu),闡明了空泡化細(xì)胞的形成過(guò)程?？张莼?xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)和PI染料染色。被PI染色時(shí),發(fā)出較強(qiáng)的熒光,說(shuō)明空泡化細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng),但是細(xì)胞膜沒(méi)有破碎,胞外也未檢測(cè)到內(nèi)容物外溢。電鏡結(jié)果顯示,正常顆粒狀細(xì)胞的細(xì)胞膜比較致密,線粒體飽滿且細(xì)胞核以及核仁完整。培養(yǎng)末期的空泡化細(xì)胞的細(xì)胞壁逐漸

4、疏松,線粒體發(fā)生了空泡化,核仁和染色質(zhì)固縮,出現(xiàn)核膜逐漸不完整等細(xì)胞凋亡特征。
　　(3)研究了細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)體系空泡化細(xì)胞出現(xiàn)前后微環(huán)境變化,分析了導(dǎo)致細(xì)胞空泡化的原因?？赡苁俏h(huán)境體系中溶氧和滲透壓在第6天的快速下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體受損,膜通透性發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　(4)初步研究了甘草細(xì)胞空泡化的調(diào)控策略。通過(guò)向培養(yǎng)體系增加溶氧、改變培養(yǎng)基的滲透壓以及不添加激素2,4-D等方式,均能緩解細(xì)胞空泡化現(xiàn)