聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測鴨瘟病毒方法的建立及鴨瘟弱毒CHa株在雛鴨體內(nèi)分布規(guī)律的研究.pdf

1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測鴨瘟病毒方法的建立及鴨瘟弱毒CHa株在雛鴨體內(nèi)分布規(guī)律的研究姓名：宋涌申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：程安春汪銘書20030501摘要本文根據(jù)基因庫(GeneBank)登載的鴨瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV＆DuckEnteritisVirus，DEV)基因組中的一個765bp長的艮D(zhuǎn)RI片段(AnatidHerpesvirus1DNAPolymeraseGe

2、ne＆UnknownGene)，運(yùn)用軟件OLIGO設(shè)計(jì)～對引物，其擴(kuò)增幅度為498bp。應(yīng)用這對引物針對鴨瘟病毒(DPV)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了與設(shè)計(jì)大小相符合的特異性條帶，成功建立了檢測鴨瘟病毒的PCR方法。確立了PCR的最佳反應(yīng)條件，引物濃度為05川d，Mg”作用濃度為25pM；最佳反應(yīng)模式為：95“(2變性5min，進(jìn)入94℃imin，518℃imin，72℃2min的循環(huán)，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后經(jīng)72℃延伸lOmin后于4℃結(jié)束

3、反應(yīng)。特異性試驗(yàn)表明，對七種對照禽病病原體(雞馬立克氏病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、鴨病毒性肝炎病毒、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨副傷寒沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌)的基因卻擴(kuò)增不出任何條帶，為陰性。敏感性試驗(yàn)表明，可檢測到lOfg的鴨瘟病毒DNA模板。本文研究了鴨瘟病毒弱毒Cha株經(jīng)皮下、口服和滴鼻三種途徑接種含母源抗體的雛鴨后，應(yīng)用本文建立的PCR方法檢測不同時間鴨瘟弱毒在鴨體各組織器官的分布規(guī)律。分別在接種后的第4h、8h、12h、24

4、h、3d、5d、7d、lOd、14d、17d和21d人工致死雛鴨，收集雛鴨的靜脈血液、心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、直腸、法氏囊、胸腺、胰腺、延腦、大腦、小腦、舌頭、肌肉、骨髓、糞便和食道共19種樣品進(jìn)行PCR檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明：①皮下組在接種后的第4h，即可在心、肝、脾、腎、法氏囊、胸腺、胰腺、延腦、大腦和小腦共lO種組織中檢出DPV的DNA，8h后所有采取的組織器官均可檢測到DPV的DNA：②口服組最早在接種后4h可在舌頭和食道中檢

5、測到DPV的DNA，8h后可在心、肝、脾、腎、胸腺、胰腺、延腦、大腦、小腦、舌頭、食道和血液共12組織器官中檢出DPV的DNA：③滴鼻組在接種后4h未能在組織中檢出DPV的DNA，8h后可在心、肝、脾、腎、胸腺、延腦、大腦、小腦、舌頭、食道和血液共11中組織中檢測到DPV的DNA。④在三種途徑中，檢出時間最早和檢出率最高的組織器官為肝臟、腦(大腦、小腦和延腦)，至第21天時均能穩(wěn)定、持續(xù)地從所采取的組織中檢測出DPV基因組。本研究建立的