1型和3型鴨甲肝病毒在臨床死亡雛鴨體內(nèi)分布的研究.pdf

1、鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis AVirus，DHAV)引起的雛鴨病毒性肝炎(Duck viralhepatitis，DVH)呈世界性分布，雛鴨發(fā)病死亡后呈現(xiàn)明顯的角弓反張癥狀，病理上以肝臟腫大出血為主要特征，具有高度傳染性和接觸性。該病發(fā)病迅速，致死率高。DHAV可分為三個基因型:DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。在我國大陸，鴨病毒性肝炎主要由DHAV-1和DHAV-3引起，兩種病毒感染雛鴨后的臨床癥狀和病理變化極為

2、相似，臨床診斷難以對其進(jìn)行區(qū)分，且生產(chǎn)中存在二者混合感染現(xiàn)象，這為該病的防治增添了困難。本研究建立了可以同時檢測DHAV-1與DHAV-3的雙重?zé)晒舛縋CR方法，并對DHAV-1和DHAV-3在山東省內(nèi)的流行病學(xué)及臨床上病毒在雛鴨體內(nèi)的分布進(jìn)行了研究。本研究主要包括兩部分:
　　1.檢測DHAV-1與DHAV-3的雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立
　　根據(jù)DHAV-1和DHAV-3基因組序列比對結(jié)果，分別于兩種病毒序列保守區(qū)設(shè)

3、計合成了兩對能特異性擴(kuò)增片段的引物和兩條TaqManTM探針，探針分別以CY5/BHQ-2和FAM/TAMRA雙標(biāo)記，建立了能夠同時檢測DHAV-1和DHAV-3的雙重?zé)晒舛縋CR診斷方法。經(jīng)條件優(yōu)化后，檢測DHAV-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為YDHAV-1=-3.2850x+40.812，相關(guān)系數(shù)為0.998，PCR循環(huán)效率為101.5％，在6.7×103～6.7×107copies/μL內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測DHAV-1病毒cDNA模板的靈

4、敏度為14copies/PCR，組內(nèi)變異系數(shù)為0.28％～1.24％，組間變異系數(shù)為0.29％～0.79％;檢測DHAV-3方法中標(biāo)準(zhǔn)曲線為YDHAV-3=-3.2791x+39.216，相關(guān)系數(shù)為0.999，PCR循環(huán)效率為101.8％，在1.1×102～1.1×107copies/μL內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測DHAV-3病毒cDNA模板的靈敏度為22copies/PCR，與單重?zé)晒舛縋CR一致，組內(nèi)變異系數(shù)為0.28％～1.81％

5、，組間變異系數(shù)為0.22％～0.72％;特異性試驗結(jié)果顯示，同一體系內(nèi)兩對特異性引物和探針只能從對應(yīng)的陽性樣本中擴(kuò)增出特異片段，DHAV-1和DHAV-3相互之間無交叉擴(kuò)增反應(yīng)，對其他七種禽類常見病原及健康鴨肝組織也無擴(kuò)增，表明其特異性良好。
　　分別應(yīng)用所建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法和常規(guī)RT-PCR方法對30份人工感染DHAV-1和DHAV-3雛鴨肝臟以及200份臨床疑似患DVH病鴨的肝臟進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示:兩種方法對人工感染

6、DHAV-1和DHAV-3雛鴨的檢測陽性率均為100％。用熒光定量PCR方法對200份疑似患鴨病毒性肝炎病鴨的肝臟的臨床樣本進(jìn)行檢測，DHAVs的檢出率為97.5％，DHAV-1的陽性檢出率為29％，DHAV-3的陽性檢測率為56.5％，混合感染陽性率為12％。送檢雛鴨共31群，4群檢出混合感染，13群DHAV-1陽性感染，13群DHAV-3陽性感染。研究結(jié)果表明建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法具有良好的特異性和敏感性，可用于快速鑒別診斷D

7、HAV-1和DHAV-3以及對感染雛鴨體內(nèi)病毒的實時定量檢測。
　　2.DHAV-1和DHAV-3在臨床中雛鴨體內(nèi)的分布規(guī)律研究
　　對臨床送檢的DHAV陽性病死雛鴨進(jìn)行各臟器的采集，包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、法氏囊、腦和胰腺，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縋CR法定量檢測DHAV-1和DHAV-3在雛鴨體內(nèi)病毒分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):被檢組織器官中均可檢測到DHAV，但不同組織中DHAV含量差異較大，表明DHAV在雛鴨體內(nèi)有廣

8、泛的組織嗜性。剖檢可見雛鴨的肝臟、脾臟和腎臟眼觀病變最為明顯，大多呈現(xiàn)腫大和出血、壞死，熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，DHAV-1和DHAV-3含量最高的器官依次為肝臟和脾臟，其中DHAV-1病毒含量依次高達(dá)1012.32和1011.23copies/g，DHAV-3病毒含量依次高達(dá)1012.07、和1011.63copies/g。剖檢胸腺、胰臟有出血現(xiàn)象，法氏囊腫大，部分腦組織出現(xiàn)水腫和液化灶。胸腺、胰臟、心臟、腦和法氏囊也可檢測到DH