同時(shí)識(shí)別1和3型鴨甲肝病毒的單抗及膠體金試紙條研究.pdf

1、鴨甲型肝炎病毒(DHAV)可引起雛鴨發(fā)生急性、高度致死性傳染病。主要感染3周齡以下的雛鴨，其中1周齡以內(nèi)的雛鴨死亡率高達(dá)95％，主要特征病變?yōu)榛疾▲喌母闻K腫大和出血。本試驗(yàn)開展了DHAV病毒單克隆抗體及膠體金試紙條制備和快速診斷等研究，結(jié)果如下:
　　1.DHAV單克隆抗體的制備及初步鑒定
　　用血清1型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-1)X株病毒尿囊液接種鴨胚，收集24-72h死亡的鴨胚尿囊液，將含DHAV-1病毒的尿囊液與等量

2、的氯仿混合，抽提3次，除去脂類以及一些雜蛋白，然后在40000 r/min離心2h，用PBS重懸病毒并使病毒蛋白含量為0.5 mg/mL，作為制備單克隆抗體的抗原免疫6周齡的BALB/c雌性小鼠。取免疫后小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤進(jìn)行了細(xì)胞融合、篩選，再用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行3次亞克隆，最終得到5株可以穩(wěn)定分泌特異性抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1#、2#、3#、4#和5#雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)鑒定，1#單克隆抗體類型屬于Ig

3、M，2#單克隆抗體類型屬于IgG1，3#單克隆抗體類型屬于IgG2b，4#和5#單克隆抗體類型屬于IgG2a。純化后單抗腹水的效價(jià)均在2×105以上;5株雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性均較好，經(jīng)過體外傳代以及細(xì)胞凍存復(fù)蘇仍能穩(wěn)定分泌抗體。5株單克隆抗體的相對(duì)親和常數(shù)都在109數(shù)量級(jí)以上，具有較好的抗原結(jié)合能力，其中3#單克隆抗體的親和力更高。
　　2.膠體金試紙條的研制及應(yīng)用
　　用純化的2#單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記制備成金標(biāo)抗體，經(jīng)過

4、試驗(yàn)條件的優(yōu)化，確定了膠體金與抗原的最佳標(biāo)記量為34μg/mL，最佳標(biāo)記的pH值確定0.1 mol/L K2CO3加入量為12μL/mL;將純化的兔抗DHAV-1多抗包被于NC膜的T線上作為檢測(cè)線，羊抗鼠IgG包被于NC膜的C線上作為對(duì)照線，制成雙抗體夾心法檢測(cè)DHAV的膠體金免疫層析試紙條。對(duì)膠體金試紙條T線和C線濃度的優(yōu)化，確定檢測(cè)線上的兔抗DHAV-1多抗的最佳標(biāo)記量為1 mg/mL，對(duì)照線上羊抗鼠IgG最佳標(biāo)記量為1 mg/mL

5、。在特異性試驗(yàn)中，檢測(cè)4株DHAV-1和6株DHAV-3呈陽性反應(yīng)，對(duì)鴨常見的其它致病病原（鴨瘟病毒、鴨大腸桿菌、鴨坦布蘇病毒、鴨沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌等）檢測(cè)均為陰性;對(duì)DHAV-1最低檢出量為0.9μg，DHAV-3最低檢出量為1.8μg。試紙條在4℃、室溫和37℃至少可以保存3個(gè)月;批間和批內(nèi)試紙條對(duì)樣品檢測(cè)的重復(fù)性較好。本試驗(yàn)制備的試紙條與RT-PCR同時(shí)檢測(cè)臨床樣本的陽性符合率為96.5％(111/115)，陰性符合率為97