瘤胃產(chǎn)甲烷菌定量檢測(cè)與微生物菌群調(diào)控研究.pdf

1、瘤胃甲烷的生成不僅是飼料能量的損失,而且通過暖氣排入大氣的甲烷是一種重要的溫室氣體。隨著全球?qū)厥覛怏w排放的重視,反芻動(dòng)物瘤胃甲烷生成受到越來(lái)越多的關(guān)注。本研究在建立分子生物學(xué)手段檢測(cè)瘤胃產(chǎn)甲烷菌及微生物菌群的基礎(chǔ)上,通過探討不同調(diào)控途徑對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌和微生物菌群的影響,研究產(chǎn)甲烷菌和微生物菌群與甲烷生成的密切關(guān)系。首先利用實(shí)時(shí)定量PCR方法,建立瘤胃產(chǎn)甲烷菌及微生物菌群的檢測(cè)技術(shù)(第一部分);然后利用產(chǎn)甲烷菌選擇性抑制劑研究產(chǎn)甲烷菌與

2、微生物菌群的變化(第二部分),并以天然調(diào)控劑茶皂素為調(diào)控手段探討其對(duì)產(chǎn)甲烷菌及瘤胃微生態(tài)的影響(第三部分);最后模擬高粗日糧條件,探討甲烷生成與瘤胃微生態(tài)的關(guān)系(第四部分)。
　　 第一部分瘤胃產(chǎn)甲烷菌及微生物菌群分子研究方法的建立
　　 建立實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌、原蟲以及主要的纖維降解微生物,并建立產(chǎn)甲烷菌活性檢測(cè)手段。以產(chǎn)甲烷短桿菌屬的模式菌種——反芻獸甲烷短桿菌(Methanobrevibacter

3、 ruminantium)為研究對(duì)象,建立實(shí)時(shí)定量PCR絕對(duì)定量法。研究發(fā)現(xiàn),熒光定量PCR方法(y)與傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法(x)對(duì)產(chǎn)甲烷菌的定量結(jié)果強(qiáng)相關(guān),y=1.0152x-3×108(r=0.9753;P＜0.01)。而后利用反轉(zhuǎn)錄Real Time PCR檢測(cè)mcrA基因表達(dá),表征產(chǎn)甲烷菌的活性。添加2-溴乙烷磺酸(BES)后,反芻獸甲烷短桿菌mcrA基因表達(dá)受抑制,培養(yǎng)30小時(shí)后其表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的1％;而添加2,4-二羥基蝶呤(Lum

4、azine)后,mcrA基因表達(dá)在前6小時(shí)內(nèi)升高,而后逐漸下降。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法定量分析混合培養(yǎng)微生物中產(chǎn)甲烷菌及主要的纖維降解微生物結(jié)果表明,各菌標(biāo)準(zhǔn)曲線可信度高,擴(kuò)增效率相近(98.4-99.9％)。體外培養(yǎng)24小時(shí)后,BES處理組的產(chǎn)甲烷菌顯著減少(P＜0.01),僅為對(duì)照組的10.3％;BES處理組的真菌數(shù)量雖然隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增長(zhǎng),但其量明顯受抑制,在培養(yǎng)12小時(shí)和24小時(shí)后分別減少40.0和61.9％;甲烷抑制組的

5、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌增加50％,而黃化瘤胃球菌數(shù)量無(wú)明顯變化。
　　 本部分研究結(jié)果表明,實(shí)時(shí)定量PCR方法可以準(zhǔn)確定量瘤胃微生物,實(shí)踐中可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x用絕對(duì)定量法或相對(duì)定量法。
　　 第二部分不同抑制劑對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌及微生物菌群的調(diào)控
　　 以混合培養(yǎng)微生物為研究對(duì)象,探討不同的選擇性抑制劑(BES,Lumazine或Mevinolin(甲基四氫蝶呤))對(duì)甲烷生成和產(chǎn)甲烷菌的調(diào)控作用。研究表明,體外培養(yǎng)24小時(shí)后

6、,三種抑制劑對(duì)甲烷生成、產(chǎn)甲烷菌含量以及產(chǎn)甲烷菌活性產(chǎn)生不同的影響。BES和Lumazine顯著降低了甲烷生成量,分別為對(duì)照組的17.2％和83.8％,Mevinolin對(duì)甲烷生成量無(wú)顯著影響。BES和Lumazine顯著降低了產(chǎn)甲烷菌的含量,分別為對(duì)照組的42.2％和60.0％。Mevinolin對(duì)產(chǎn)甲烷菌沒有顯著影響。培養(yǎng)24小時(shí)后,BES顯著抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性,僅為對(duì)照組的1％。Lumazine組mcrA基因表達(dá)量在前12小時(shí)有

7、所下降,24小時(shí)后比對(duì)照組高19％。Mevinolin組mcrA基因表達(dá)量在前12小時(shí)內(nèi)無(wú)顯著變化,24小時(shí)后比對(duì)照組高45％。DGGE結(jié)果表明,抑制劑降低了某些優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌的代謝活性。三種抑制劑顯著提高了原蟲數(shù)量,BES、Lumazine和Mevinolin組的原蟲數(shù)較對(duì)照組分別提高42.3％、65.3％和27.5％。BES顯著降低了真菌數(shù)量(P＜0.05),為對(duì)照組的71.9％,Lumazine和Mevinolin提高了真菌數(shù)量(P

8、＜0.05),分別較對(duì)照組提高43.8％和37.5％。BES增加產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量(P＜0.05),降低黃色瘤胃球菌數(shù)量;Lumazine降低兩種纖維降解菌數(shù)量;Mevinolin降低產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量(P＜0.05),增加黃色瘤胃球菌的數(shù)量(P＜0.05)。PCR-DGGE結(jié)果表明,16S rRNA擴(kuò)增子獲得的條帶較16S rDNA擴(kuò)增子獲得條帶數(shù)更多,說(shuō)明混合微生物中代謝活性微生物菌群與微生物優(yōu)勢(shì)菌群的組成不同,而且BES和L

9、umazine對(duì)代謝活性微生物區(qū)系的影響更大。
　　 直接作用于甲烷生成途徑的BES和Lumazine對(duì)產(chǎn)甲烷菌、mcrA基因表達(dá)和微生物區(qū)系的影響更大,Mevinolin影響產(chǎn)甲烷菌細(xì)胞壁的合成,其作用效果不如前二者明顯。
　　 第三部分茶皂素對(duì)產(chǎn)甲烷菌及瘤胃微生物菌群的調(diào)控效果研究
　　 研究茶皂素對(duì)瘤胃微生物菌群、產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與活性和純培養(yǎng)反芻獸甲烷短桿菌的影響,探討茶皂素降低瘤胃甲烷生成的作用機(jī)理。研究表

10、明,茶皂素減少原蟲數(shù)量,添加0.2和0.4 mg/ml的茶皂素組中原蟲數(shù)量分別減少了51.2％和22.9％(P＜0.05)。產(chǎn)甲烷細(xì)菌的數(shù)量并未受茶皂素的影響(P＞0.05),表明甲烷產(chǎn)生并不完全對(duì)應(yīng)于產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量變化。在混合培養(yǎng)微生物中,茶皂素顯著抑制了混合培養(yǎng)微生物的mcrA基因表達(dá),茶皂素處理組的mcrA基因表達(dá)較對(duì)照組降低了76％。以反芻獸甲烷短桿菌為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)茶皂素對(duì)瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌——反芻獸甲烷短桿菌無(wú)明顯抑制作用。

11、
　　 這些結(jié)果表明,茶皂素可以抑制原蟲,從而抑制甲烷的生成。茶皂素對(duì)瘤胃內(nèi)主要產(chǎn)甲烷菌沒有直接影響,推測(cè)茶皂素通過抑制原蟲作用影響氫氣生成量,間接降低產(chǎn)甲烷菌活性。產(chǎn)甲烷菌活性,即mcrA基因表達(dá)可以更好地預(yù)測(cè)復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)中甲烷生成的變化規(guī)律。
　　 第四部分高粗日糧對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌及微生物菌群的調(diào)控研究
　　 試驗(yàn)采用不同纖維來(lái)源及水平的NDF模擬高粗日糧條件下瘤胃的發(fā)酵模式,比較不同來(lái)源及水平的NDF對(duì)瘤胃

12、產(chǎn)甲烷菌及微生物菌群的影響。不同來(lái)源的NDF對(duì)甲烷生成及產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了顯著影響,苜蓿NDF組與全株玉米青貯NDF組的產(chǎn)甲烷菌區(qū)系類似,相似性指數(shù)為93.3％;黑麥草與黑麥草青貯NDF組區(qū)系的相似性指數(shù)為87.1％。體外培養(yǎng)24小時(shí)后,NDF來(lái)源、水平及兩者的互作對(duì)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生極顯著影響(P＜0.01);苜蓿NDF與淀粉以60∶40組合時(shí),產(chǎn)甲烷菌數(shù)量最低;100％黑麥草為培養(yǎng)底物時(shí),產(chǎn)甲烷菌數(shù)量最高。產(chǎn)甲烷菌與甲烷生成呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。不同

13、水平黑麥草青貯NDF對(duì)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌影響不大,產(chǎn)甲烷菌相似性指數(shù)在91.1％到96.6％之間;但不同水平NDF影響了微生物區(qū)系,其相似性指數(shù)降到46％～72％。
　　 甲烷生成量與產(chǎn)甲烷菌和兩種纖維降解菌呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與原蟲無(wú)相關(guān)性。產(chǎn)甲烷菌與真菌呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.0099),與其他菌不存在顯著相關(guān)關(guān)系。
　　 綜上所述,通過分析產(chǎn)甲烷菌數(shù)量及其mcrA基因表達(dá),可以預(yù)測(cè)瘤胃內(nèi)甲烷的生成;產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與原蟲數(shù)不完全相關(guān)