沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌分子多樣性研究及產(chǎn)甲烷菌的分離.pdf

1、沼氣發(fā)酵過程是一個(gè)由多種微生物聯(lián)合，交替作用的復(fù)雜生化過程。在發(fā)酵過程中，不產(chǎn)甲烷細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌之間，相互依賴，又互相制約，在發(fā)酵過程中處于平衡狀態(tài)。而在發(fā)酵過程中微生物的代謝活動(dòng)與相互作用也體現(xiàn)在發(fā)酵反應(yīng)中物料的理化性質(zhì)的改變上。 在沼氣發(fā)酵中，產(chǎn)甲烷菌是沼氣發(fā)酵微生物的核心，作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物鏈的最后一個(gè)成員，分析沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌的變化，對(duì)于了解發(fā)酵程度，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高沼氣產(chǎn)量，具有十分重要的意義。目前已

2、知，自然環(huán)境中的微生物有90-99％是還未可培養(yǎng)的，加之產(chǎn)甲烷菌的嚴(yán)格厭氧性、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，使得通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術(shù)對(duì)產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的分析十分困難，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是16SrDNA分析的方法引入?yún)捬醐h(huán)境微生物群落的研究中，使得快速、全面、準(zhǔn)確地研究厭氧系統(tǒng)內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)的多樣性成為可能。 本文研究了以奶牛糞便為原料的沼氣發(fā)酵過程中的物料理化性質(zhì)的改變、參與發(fā)酵過程的六大微生物生理群的數(shù)量變化。同時(shí)采

3、用不依賴于培養(yǎng)的16SrDNA分析的方法研究了沼氣發(fā)酵的不同階段沼液中產(chǎn)甲烷菌的多樣性的變化。并通過傳統(tǒng)的Hungate厭氧技術(shù)從發(fā)酵液中分離出產(chǎn)甲烷菌并進(jìn)行了初步的鑒定。 一、沼氣發(fā)酵過程中主要微生物生理群的演替與物料的變化研究了以奶牛糞便為原料的沼氣發(fā)酵過程中六大微生物生理群(好氧產(chǎn)酸菌、厭氧產(chǎn)酸菌、好氧氨化菌、厭氧氨化菌、厭氧纖維素降解菌、產(chǎn)甲烷菌)數(shù)量的變化，以及在此過程中物料理化性質(zhì)的變化。實(shí)驗(yàn)表明：發(fā)酵前期，以好氧微

4、生物活動(dòng)為主，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，厭氧微生物，特別是產(chǎn)甲烷菌的作用越來(lái)越顯著。 在發(fā)酵過程中，揮發(fā)性有機(jī)酸，全氮、pH、氧化還原電位都發(fā)生變化，其變化與沼液中微生物類群變化相關(guān)。 二、沼液總DNA的提取和純化方法通過直接提取法和間接提取法的比較，確立了從沼液中提取總DNA的方法。比較結(jié)果表明，盡管直接提取法的得率要高于間接法，但由于沼液樣品中的腐殖質(zhì)等雜質(zhì)的含量較高，經(jīng)過純化回收后的直接法提取的總DNA，仍無(wú)法通過PCR擴(kuò)增

5、的方法得到所需的片斷，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。而間接法的得率雖然較低，但所得總DNA純度高，無(wú)需純化，即可進(jìn)行后續(xù)操作。 三、沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷多樣性的變化采用不依賴于培養(yǎng)的16SrDNA分析的方法研究了沼氣發(fā)酵的不同階段產(chǎn)甲烷菌的多樣性的改變。首先提取了發(fā)酵前、發(fā)酵啟動(dòng)期、盛產(chǎn)期前期、盛產(chǎn)期、發(fā)酵末期五個(gè)階段的沼液總DNA，應(yīng)用產(chǎn)甲烷菌特異性的16SrDNA引物通過PCR擴(kuò)增了五個(gè)階段的沼液樣品的總DNA，建立了五個(gè)沼液樣品16S

6、rDNA文庫(kù)，應(yīng)用HaeⅢ-HpaⅡ兩種四堿基限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)五個(gè)文庫(kù)中的16SrDNA片段進(jìn)行了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。共獲得127種酶切類型。應(yīng)用各種多樣性和均度參數(shù)對(duì)五個(gè)文庫(kù)HaeⅢ-HpaⅡ酶切類型的豐富度和分布進(jìn)行了比較。對(duì)五個(gè)文庫(kù)的16SrDNA主要HaeⅢ-HpaⅡ酶切類型的系統(tǒng)發(fā)育分析表明產(chǎn)甲烷菌群落發(fā)生了顯著的變化。在發(fā)酵的五個(gè)不同階段都存在著相同的產(chǎn)甲烷菌類群—甲烷粒菌，而在五個(gè)階段也存在著各自不同的優(yōu)勢(shì)地位的產(chǎn)

7、甲烷菌類群，如發(fā)酵前的基質(zhì)中主要的產(chǎn)甲烷菌類群為甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)、甲烷螺菌屬(Methanospirillum)和甲烷微菌屬(Methanomicrobiaceae)以及未可培養(yǎng)的瘤胃甲烷菌(unculturedrumenmethanogen)的成員，而發(fā)酵啟動(dòng)期、發(fā)酵盛產(chǎn)期初期、發(fā)酵盛產(chǎn)期的沼液中主要的產(chǎn)甲烷菌類群為甲烷球菌屬(Methanococcus)以及甲烷粒菌屬(Methanocorpuscu

8、lum)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)的成員。發(fā)酵末期的發(fā)酵液主要類群則屬于甲烷粒菌屬(Methanocorpusculum)、甲烷袋狀菌屬(Methanoculleus)和鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta)。這一結(jié)論表明，發(fā)酵起始時(shí)的優(yōu)勢(shì)種群并不是盛產(chǎn)期時(shí)的優(yōu)勢(shì)類群，也推翻了人們通常認(rèn)為牛糞本身就含有產(chǎn)甲烷菌而無(wú)需調(diào)試的錯(cuò)誤觀點(diǎn)。 四、發(fā)酵沼液中分離產(chǎn)甲烷菌的分離與初步鑒定采用Hungate厭氧技術(shù)分離

9、，從發(fā)酵前，發(fā)酵盛產(chǎn)期、發(fā)酵末期的沼液中各分離出一株產(chǎn)甲烷菌，經(jīng)生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步在屬水平上講NY-1確定為Methanobrevibactersp.，NF-1確定為Methanoculleussp.，NW-1確定為Methanosaetasp.。所分離到的產(chǎn)甲烷菌是各階段的優(yōu)勢(shì)類群，但通過分子生物學(xué)方法分析得到的各階段的最優(yōu)勢(shì)類群往往并沒有通過分離技術(shù)得到。表明：與分子方法所得的結(jié)果既相關(guān)，又不完全一致。實(shí)際研究中，應(yīng)該