厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及其代謝與菌群變化的研究.pdf

1、甲烷是瘤胃微生物代謝的終產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生既損失能量，又增加溫室氣體負(fù)荷，因此瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究越來越受到重視.本論文報(bào)告了來自瘤胃內(nèi)容物的混合厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌在產(chǎn)甲烷過程中的相互關(guān)系。首先建立了瘤胃產(chǎn)甲烷菌DGGE分析方法；通過體外連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌的共培養(yǎng)物，研究產(chǎn)甲烷菌對(duì)厭氧真菌代謝的影響，厭氧真菌活力對(duì)甲烷菌甲烷產(chǎn)生能力的影響及傳代過程中真菌與產(chǎn)甲烷菌菌群的變化；最后，分離培養(yǎng)相關(guān)瘤胃厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌。試驗(yàn)共

2、分為4部分： 1、瘤胃古菌DGGE分子生態(tài)學(xué)研究方法的建立 本試驗(yàn)建立了瘤胃古菌16S rRNA基因的DGGE分析方法.首先利用瘤胃液總DNA及細(xì)菌DNA，比較了10對(duì)用于古菌16S rRNA基因DGGE分析的PCR引物，其中6對(duì)為直接PCR擴(kuò)增引物，4對(duì)巢式PCR擴(kuò)增引物.經(jīng)過PCR初步篩選，確定三對(duì)直接PCR擴(kuò)增引物(519f/915rGC，1106fGC/1378r和344fGC/915r)可用于瘤胃古菌的DGGE

3、分析。引物519f/915rGC和1106fGC/1378r得到了條帶清晰的DGGE電泳圖譜，從圖譜中分別獲得33個(gè)和6個(gè)條帶，而引物344fGC/915r的DGGE圖譜中只得到一條電泳條帶。將所有DGGE圖譜中的條帶切膠回收核酸，克隆，測(cè)序.所有條帶都屬于產(chǎn)甲烷菌16S rRNA基因序列.結(jié)果顯示，引物519f/915rGC能擴(kuò)增瘤胃液得到較好的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物用于DGGE電泳，獲得條帶清晰的電泳圖譜，測(cè)序結(jié)果表明，DGGE膠上的條

4、帶屬于甲烷短桿菌及一類未培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌，該引物較適合用于瘤胃古菌的DGGE分析。 2、瘤胃厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及菌群多樣性分析 根據(jù)瘤胃微生物對(duì)抗生素的敏感性，用青霉素和鏈霉素抑制細(xì)菌生長，通過體外分離培養(yǎng)方法獲得厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)液.對(duì)共培養(yǎng)傳代62次，取第5、15、25、35、45、55、62代共培養(yǎng)液樣品進(jìn)行分析，研究該共培養(yǎng)液中厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌的種類及多樣性變化.結(jié)果顯示：瘤胃液中厭氧真菌復(fù)雜

5、多樣，ARISA圖譜中共出現(xiàn)13個(gè)峰；但在厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌的共培養(yǎng)液中，厭氧真菌多樣性降低，從第5代至62代，ARISA圖譜相似，只出現(xiàn)3個(gè)峰；這些厭氧真菌在共培養(yǎng)液傳代過程中一直穩(wěn)定存在.瘤胃液中的產(chǎn)甲烷菌復(fù)雜多樣，DGGE圖譜中共出現(xiàn)17個(gè)條帶；共培養(yǎng)液中，產(chǎn)甲烷菌多樣性降低，但與厭氧真菌相比較為復(fù)雜；隨著共培養(yǎng)液的傳代培養(yǎng)，產(chǎn)甲烷菌多樣性逐漸降低，到第62代時(shí)，產(chǎn)甲烷菌DGGE圖譜中僅有2個(gè)條帶。對(duì)第25代共培養(yǎng)液中的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)

6、行克隆測(cè)序，共得到13個(gè)不同的16S rRNA基因序列，其中12個(gè)與甲烷短桿菌相似，剩下的一個(gè)基因序列與現(xiàn)有的甲烷菌序列相似性低于80％，可能屬于甲烷菌的一個(gè)新的目。根據(jù)該新的可培養(yǎng)未知產(chǎn)甲烷菌16SrDNA序列的特征，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物擴(kuò)增該產(chǎn)甲烷菌，并對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了該產(chǎn)甲烷菌的PCR檢測(cè)方法。綜上所述：本研究建立了厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌體外共培養(yǎng)體系，并分析了共培養(yǎng)體系中的菌群多樣性，與瘤胃液相比，共培養(yǎng)系統(tǒng)中厭氧

7、真菌菌群較為簡單，共培養(yǎng)體系中的產(chǎn)甲烷菌主要是甲烷短桿菌和一類可培養(yǎng)的未知產(chǎn)甲烷菌，進(jìn)而建立了該可培養(yǎng)未知產(chǎn)甲烷菌的PCR檢測(cè)方法。 3、厭氧真菌活力及傳代頻率對(duì)真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)液的影響 厭氧真菌體外傳代培養(yǎng)時(shí)，其活力受每代生長時(shí)間(即傳代頻率)的影響.本試驗(yàn)從瘤胃中獲得厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)液，以不同的傳代頻率(3 d代，5 d/代，7 d/代)進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，共傳代9次，測(cè)定不同傳代頻率下，共培養(yǎng)液的發(fā)酵產(chǎn)氣

8、量、代謝產(chǎn)物、厭氧真菌多樣性、產(chǎn)甲烷菌多樣性及檢測(cè)新的可培養(yǎng)未知產(chǎn)甲烷菌，結(jié)果顯示：三種不同傳代頻率的共培養(yǎng)液中，只有少量乳酸(基本低于1.5 mM)、甲酸(低于0.1 mM)、丙酸、丁酸和戊酸存在；各培養(yǎng)液pH值差異不顯著(處于6.5±0.2范圍內(nèi))；5 d和7 d傳代的共培養(yǎng)液的總產(chǎn)氣量(高于200 mL)顯著高于3 d傳代的共培養(yǎng)液(低于150 mL)；在7d傳代的共培養(yǎng)液中，其24-72 h的平均產(chǎn)氣量呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)；7d傳代的

9、共培養(yǎng)液中甲烷產(chǎn)量顯著高于3d和5d傳代的共培養(yǎng)液；共培養(yǎng)液在傳代過程中厭氧真菌的多樣性逐漸降低，到第9代時(shí)趨于穩(wěn)定，此時(shí)5d和7d傳代的共培養(yǎng)液中厭氧真菌的種類與3d傳代的共培養(yǎng)液不同；在共培養(yǎng)液的整個(gè)傳代過程中產(chǎn)甲烷菌菌群一直維持復(fù)雜多樣，沒有明顯的變化規(guī)律，并且本試驗(yàn)所用的兩種內(nèi)切酶Msp I和Taq I所得的結(jié)果有所差別；到第9代時(shí)，在3d傳代的共培養(yǎng)液中不能檢測(cè)到新的可培養(yǎng)未知甲烷菌，在5d和7d傳代的共培養(yǎng)液中能檢測(cè)到該菌。

10、與純的真菌培養(yǎng)液相比，所有共培養(yǎng)液的產(chǎn)氣量顯著提高；乙酸產(chǎn)量顯著提高；甲酸和乳酸濃度顯著降低：并且共培養(yǎng)液中真菌的多樣性高于純的真菌培養(yǎng)液，即在沒有產(chǎn)甲烷菌存在的情況下，真菌的多樣性也有所降低。綜上所述，本研究探討了厭氧真菌活力及傳代頻率對(duì)真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)系統(tǒng)菌群及代謝的影響，隨著傳代次數(shù)增加，共培養(yǎng)體系中厭氧真菌與產(chǎn)甲烷菌菌群數(shù)量降低，共培養(yǎng)體系中的微生物菌群受傳代頻率的影響；傳代頻率降低(間隔時(shí)間長)，共培養(yǎng)體系中的代謝產(chǎn)物累積

11、增加.與純真菌培養(yǎng)液相比，共培養(yǎng)體系能維持較高的菌群多樣性，能減少共培養(yǎng)體系中代謝產(chǎn)物的積累. 4、瘤胃產(chǎn)甲烷菌與厭氧真菌的分離培養(yǎng) 本研究利用Hungate滾管法對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌及厭氧真菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，并對(duì)產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行了16S rRNA基因序列的測(cè)序鑒定，對(duì)厭氧真菌進(jìn)行了ARISA分析.共得產(chǎn)甲烷菌4株，分別屬于Methanobacterium bezjingense，Methanobacterium formicic

12、um，Methanoculleus sp.，Methanosarcina mazei，其中首次從瘤胃內(nèi)分離培養(yǎng)到Methanobacterium beijingense；得到厭氧真菌6株，它們分別屬于Caecomyces屬和Neocallimastix屬，對(duì)這6株真菌的ARISA分析結(jié)果表明，其中5株真菌的ARISA圖譜相似，可能屬于同一種真菌，結(jié)論：本研究共分離培養(yǎng)到4株產(chǎn)甲烷菌和6株厭氧真菌，并首次從瘤胃內(nèi)分離培養(yǎng)到產(chǎn)甲烷菌Meth