產(chǎn)甲烷菌的分離、培養(yǎng)及鑒定方法

1、產(chǎn)甲烷菌是一類以產(chǎn)生大量甲烷氣體作為能量代謝的終產(chǎn)物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環(huán)境中。作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物處理的最后一個(gè)成員，該菌與其它菌群協(xié)同作用，將大量的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成可再生能源，對自然界中的物質(zhì)循環(huán)及當(dāng)今社會(huì)能源危機(jī)中的能源替代問題具有極大的推動(dòng)作用。通過本實(shí)驗(yàn)，我們可掌握產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的一般方法，能夠?qū)崟r(shí)觀察產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)特征并了解產(chǎn)甲烷菌的生長特性。摘要摘要產(chǎn)甲烷菌是一類以產(chǎn)生大量甲

2、烷氣體作為能量代謝的終產(chǎn)物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環(huán)境中。作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物處理的最后一個(gè)成員，該菌與其它菌群協(xié)同作用，將大量的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成可再生能源，對自然界中的物質(zhì)循環(huán)及當(dāng)今社會(huì)能源危機(jī)中的能源替代問題具有極大的推動(dòng)作用。通過本實(shí)驗(yàn)，我們可掌握產(chǎn)甲烷菌等厭氧菌的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的一般方法，能夠?qū)崟r(shí)觀察產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)特征并了解產(chǎn)甲烷菌的生長特性。一、實(shí)驗(yàn)原理(一)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷菌厭氧微生物在自然界分布廣泛

3、，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。產(chǎn)甲烷菌是專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，產(chǎn)甲烷菌的分離、培養(yǎng)及活菌計(jì)數(shù)的關(guān)鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養(yǎng)環(huán)境。(二)產(chǎn)甲烷菌的發(fā)現(xiàn)歷史產(chǎn)甲烷菌的發(fā)現(xiàn)歷史自1901—1903年巴斯德研究所的馬載（Maze）第一次觀察到一種產(chǎn)甲烷菌的微球菌（馬氏甲烷球菌）以來，迄今共發(fā)現(xiàn)了五十多種產(chǎn)甲烷菌。1974年Bryant提出產(chǎn)甲烷菌這一名詞，為避免這一類細(xì)菌與氧化甲烷的好氧菌相混淆。1979年由Ba

4、lchW.E.等人根據(jù)菌株間16SrRNA降解后各寡核苷酸中堿基排列順序間相似性的大小，提出了一個(gè)新的系統(tǒng)分類方法，共分為3個(gè)目、4個(gè)科、7個(gè)屬、13個(gè)種。(三)定義、性質(zhì)及分布定義、性質(zhì)及分布產(chǎn)甲烷菌（Mathanogens）是一類必須生活在厭氧生境下并伴有甲烷產(chǎn)生的古生菌，其形態(tài)和生理、生化特性呈現(xiàn)明顯的多樣性。它生長的氧化還原電位約為0.33V，最適生長溫度為35—40度，最適pH為6.07.2。例如細(xì)胞形態(tài)有球狀、短桿狀、長桿狀

5、、螺旋狀和絲狀等；Gram染色反應(yīng)有陽性、陰性和不定性；生長所需碳源約有10多種，除CO2外，還有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有當(dāng)產(chǎn)甲烷菌在利用H2作CO2還原劑以產(chǎn)生生物合成所需細(xì)胞物質(zhì)，才能利用CO2作電子受體以產(chǎn)生ATP和CH4。產(chǎn)甲烷菌廣泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和動(dòng)物的腸道、昆蟲的腸道、濕樹木、地?zé)崛?、深?；鹕娇?、水田和海洋的沉積物、沼澤等厭氧環(huán)境中都有產(chǎn)甲烷菌存在。(四)產(chǎn)甲烷菌的培

6、養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)1.銅柱系統(tǒng)除氧銅柱是一個(gè)內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故當(dāng)這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏?。?dāng)向氧化狀的銅柱通入H2時(shí)，H2與CuO

7、中的氧就結(jié)合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色。此銅柱可以反復(fù)的使用，并不斷起到除氧的目的。當(dāng)然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。2.預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，制作預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液時(shí)，先將配置好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時(shí)可以清楚的看到培養(yǎng)基內(nèi)加

8、入的氧化還原指示劑—刃天青由藍(lán)到紅最后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，于滅氧罐中滅菌備用。3.分離(1)編號取五支無菌水試管，分別用記號筆標(biāo)明101、102……105。(2)稀釋在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成101稀釋液。用無菌注射器吸取1mL101稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，

9、制成102稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋，至106，制成不同樣品稀釋液。通常選104、105、106三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管計(jì)數(shù)。(3)滾管分離①滾管將無氧無菌的瓊脂培養(yǎng)基在沸水浴中溶化，置4650℃恒溫的水浴中，待用，當(dāng)培養(yǎng)基從瓶中取出時(shí)，要用N2在培養(yǎng)基內(nèi)中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內(nèi)空氣，然后把培養(yǎng)基加入管內(nèi)，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內(nèi)，及時(shí)拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取104、105、106三個(gè)稀釋度各0.1mL，分別注