石斑魚虹彩病毒(SGIV)DNA疫苗的篩選及囊膜蛋白VP16的特征分析.pdf

1、近年來，高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展帶來了水環(huán)境污染的日益加劇，致使各種水產(chǎn)病害特別是病毒性疾病大規(guī)模爆發(fā)，給魚類養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟損失。新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)就是一種從養(yǎng)殖的石斑魚中分離到的水產(chǎn)動物重要病毒病原。魚類細胞培養(yǎng)是進行魚類病毒分離繁殖，進而研究魚類病毒的致病機理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基礎一步。而疫苗作為化學藥品和抗生素的替代品，是治療疾病、特別

2、是病毒病的最好選擇。本研究建立了赤點石斑魚肝組織細胞系，同時根據(jù)SGIV全基因組序列信息，運用反向疫苗學分析方法，從大量的病毒編碼基因中鑒定到了3個能產(chǎn)生明顯保護作用的基因，同時對SGIV囊膜蛋白VP16的分子特征進行了分析。結果簡述如下：
　　 1)赤點石斑魚肝組織細胞系的建立與特征分析。細胞在溫度25-30℃、含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中增殖良好。在25℃培養(yǎng)條件下，細胞生長速率隨著血清濃度(5-20％)的升高而增加，最

3、佳血清濃度為15-20％。染色體分析顯示特征染色體數(shù)目為48條。本研究進一步分析了細胞對4種魚類病毒的敏感性，結果顯示僅有SGIV感染的細胞觀察到了明顯的細胞病變效應，免疫熒光和電鏡觀察進一步確認了細胞的SGIV敏感性。細胞轉染pEGFP-N3質粒后觀察到了明顯的綠色熒光，說明此細胞系能夠用于轉基因和基因遺傳操作。
　　 2)SGIV DNA疫苗候選基因的鑒定。運用反向疫苗學的分析方法，利用一系列生物信息學工具從SGIV全基因組

4、序列中篩選到了13個疫苗候選基因，克隆到真核表達載體pcDNA3.1，免疫石斑魚幼魚，鑒定到了3個能產(chǎn)生明顯保護作用的基因。
　　 3)SGIV VP16的克隆及分子特征分析。從SGIV全基因組中克隆了VP16編碼基因全長，原核表達純化并免疫小鼠制備了抗體。序列分析表明，VP16編碼基因是蛙病毒屬特有的基因。RT-PCR、Western-blot分析與藥物抑制實驗揭示該基因是一個晚期基因。免疫熒光觀察結果表明，VP16在感染細胞