中華絨螯蟹PDGF-VEGDF和Astakine基因的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、中華絨螯蟹是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，但近年來(lái)疾病的頻繁發(fā)生給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前病害問(wèn)題已經(jīng)成為嚴(yán)重制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要障礙。從中華絨螯蟹機(jī)體本身入手，研究其免疫防御機(jī)制，從而制定合理的“綠色、環(huán)保”的養(yǎng)殖策略，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展及人類健康都具有重要意義。細(xì)胞因子作為免疫活性細(xì)胞間相互作用的介質(zhì)，對(duì)免疫應(yīng)答的發(fā)生、調(diào)節(jié)及效應(yīng)等均起重要作用。他們參與許多細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞增殖，分化，細(xì)胞膜表面的受體激活及細(xì)胞因子有關(guān)

2、的基因調(diào)控。
　　 本研究采用大規(guī)模EST測(cè)序方法，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)從中華絨螯蟹中克隆到了PDGF/VEGF和Astakine基因的cDNA全長(zhǎng)序列：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了這兩個(gè)基因在健康個(gè)體中的組織分布以及鰻弧菌和酵母菌刺激后血淋巴細(xì)胞中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律；同時(shí)，將PDGF/VEGF的編碼區(qū)克隆到pET30(a+)載體中，在大腸桿菌

3、中實(shí)現(xiàn)了重組表達(dá)，并進(jìn)行了體外活性檢測(cè)。
　　 本研究從中華絨螯蟹中克隆了PDGF/VEGF（命名為EsPDGF/VEGF），其cDNA全長(zhǎng)為1773bp，5’非翻譯區(qū)為54bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?88bp，編碼一條由196個(gè)氨基酸殘基組成的多聚肽，其理論分子量為20.2kDa，等電點(diǎn)為7.46，3’非翻譯區(qū)為1131bp。經(jīng)SignalP和SMART預(yù)測(cè)有一個(gè)信號(hào)肽及典型的PDGF結(jié)構(gòu)域。推導(dǎo)的EsPDGF/VEGF氨基酸序列與其

4、他已知的PDGF/VEGF氨基酸序列具有一定的同源性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)組織分布顯示，EsPDGF/VEGF在血淋巴、肝胰腺和肌肉組織中的表達(dá)量較高，在性腺、腮和心臟組織中的表達(dá)量較低。在中華絨螯蟹受到鰻弧菌刺激后，EsPDGF/VEGF的表達(dá)量在24hr時(shí)與空白組相比具有極顯著性差異：受到酵母菌刺激后，EsPDGF/VEGF基因的表達(dá)量與空白組相比在3hr時(shí)具有極顯著性差異，在12、24和48hr時(shí)具有顯著性差異，表明該基

5、因參與中華絨螯蟹對(duì)入侵病原菌的防御反應(yīng)。當(dāng)中華絨螯蟹受到損傷刺激時(shí)，EsPDGF/VEGF的表達(dá)量在8hr時(shí)達(dá)到了空白組的2269倍，說(shuō)明EsPDGF/VEGF參與了中華絨螯蟹機(jī)體損傷的組織修復(fù)。將EsPDGF/VEGF的編碼區(qū)片段重組到nET-30(a+）載體上，在BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白，該重組蛋白對(duì)生物胺（多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素）的釋放有促進(jìn)作用。
　　 本文克隆了中華絨螯蟹Astakine基因(命名為Es

6、Astakine)cDNA序列。cDNA全長(zhǎng)1163bp，5’非翻譯區(qū)為120bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?87bp，編碼128個(gè)氨基酸，其理論分子量為31.8，等電點(diǎn)為5.18，3’非翻譯區(qū)為656bp。經(jīng)SignalP預(yù)測(cè)沒(méi)有信號(hào)肽，但是經(jīng)SMART程序預(yù)測(cè)EsAstakine有一個(gè)prokineticin結(jié)構(gòu)域。推導(dǎo)的EsAstakine氨基酸序列與其他已知的Astakines氨基酸序列具有一定的同源性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)組織分