中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1的表達(dá)研究.pdf

1、第一章中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1和甲殼動(dòng)物結(jié)構(gòu)基因的研究現(xiàn)狀中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1系馬長艷于2003年利用差減雜交技術(shù)獲得的中華絨螯蟹Ⅲ期卵巢的高表達(dá)基因，該基因cDNA序列全長876 bp、編碼252個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)分子量大小28.18 kDa。 結(jié)構(gòu)基因指決定某種多肽鏈(蛋白質(zhì))或酶分子結(jié)構(gòu)的基因。本章重點(diǎn)敘述甲殼動(dòng)物結(jié)構(gòu)基因近10年的研究進(jìn)展。 中華絨螯蟹卵巢是中華絨螯蟹的雌性性腺，本章敘述了近年來中

2、華絨螯蟹卵巢在生理學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究。 第二章中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1在大腸桿菌(Escherichia coli)BL2l(DE3) 中的表達(dá)以有EJO1基因cDNA的pMD18-T載體為模板，利用ex3591、ex3592引物進(jìn)行擴(kuò)增得到帶BamH I和Xho I識(shí)別位點(diǎn)的EJO1開放閱讀框，PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接并進(jìn)行BamH I和Xho I雙酶切，目的片段經(jīng)切膠純化回收。將回收的EJO1基因

3、片段插入用BamH I和Xho I雙酶切的pET28b載體中，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pET28b-EJO1。將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b-EJO1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2l(DE3)，用終濃度為0.1 mm01/L的IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，并于各不同時(shí)間點(diǎn)收集菌液，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠分析。結(jié)果表明，在(Mr)略大于30 kDa處有特異蛋白條帶，其中誘導(dǎo)6小時(shí)的表達(dá)量最大，表達(dá)產(chǎn)物分子量與推算的融合蛋白分子量(32 kDa)相符，故初

4、步判定為目的蛋白。經(jīng)過鎳離子柱親和層析進(jìn)一步純化得到純度較高的EJO1-HIS<,6>(PRO)融合蛋白。 第三章中華絨螯蟹卵巢新基因EJO1在畢氏酵母(Pichia pastoris)中的表達(dá) 以有EJO1基因cDNA的pMDl8-T載體為模板，利用eukl、euk2引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶Xho I和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)的EJO1開放閱讀框，PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接并進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切，目的

5、片段經(jīng)切膠純化回收。將回收的EJ01基因片段插入用Xho I和EcorI雙酶切的pPIC9載體中，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-EJO1。將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-EJO1進(jìn)行Bgl II酶切線性化，經(jīng)切膠純化后電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GSll5，篩選的陽性克隆經(jīng)甲醇誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析。結(jié)果表明，在(Mr)略大于30 kDa處有特異蛋白條帶，與推算的融合蛋白分子量32 kDa相符，故初步判定為目的蛋白EJO