中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)生殖相關(guān)基因的克隆及其表達(dá)模式研究.pdf

1、生殖細(xì)胞的發(fā)生是發(fā)育生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，同時也是一個復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控并涉及時空的多基因活動過程。其中原始生殖細(xì)胞起源、遷徙、分化等方面的研究，是備受關(guān)注的生物學(xué)研究方向。與其他模式生物相比，十足目動物關(guān)于生殖發(fā)育的分子機(jī)制方面的研究相對薄弱。因此，鑒定和發(fā)現(xiàn)十足目生殖相關(guān)的基因并探索其功能，具有重要意義和潛在的應(yīng)用價值。本文以中華絨螯蟹為研究對象，通過現(xiàn)有研究和相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，對與中華絨螯蟹生殖發(fā)育有著密切聯(lián)系的vasa、piwi、

2、nanos、PL10基因進(jìn)行研究。研究主要分為四個部分：
　　1、中華絨螯蟹vasa基因的表達(dá)分析及表達(dá)模式研究
　　vasa基因是生殖質(zhì)的主要組成成分之一，且在生殖腺中特異性表達(dá)，?？勺鳛槭聚櫳诚傩纬傻姆肿訕?biāo)記。本文采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對vasa基因在中華絨螯蟹胚胎及幼體發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，vasa mRNA在胚胎發(fā)育時期表達(dá)量相對幼體發(fā)育階段表達(dá)量要高，推測vasa mRNA可能主要作用于胚胎

3、發(fā)育階段。對精巢和卵巢的原位雜交結(jié)果表明，vasa mRNA在精母細(xì)胞中分布于染色質(zhì)中，在精子細(xì)胞中主要分布于核杯，在卵母細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)，胚胎和幼體發(fā)育時期vasa mRNA表達(dá)集中分布，可根據(jù)vasa mRNA的分布初步推斷中華絨螯蟹的性腺生成軌跡。
　　2、中華絨螯蟹piwi基因克隆及表達(dá)研究
　　Piwi基因在果蠅中有維持生殖干細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的功能，甲殼類中對此基因的研究非常少。本文采用SMA

4、RTTM RACE技術(shù)，克隆了piwi基因全長序列。piwi基因的cDNA全長3253bp（GenBank注冊號：KR061909），5’UTR26bp，3’UTR179bp，開放閱讀框ORF2868bp，編碼955個氨基酸。多序列比對和同源性分析表明中華絨螯蟹的piwi基因和三疣梭子蟹的piwi基因同源性為70％?？缒^(qū)分析表明PIWI蛋白為親水性蛋白結(jié)構(gòu)。通過實(shí)時熒光定量PCR分析表明，piwi mRNA在血液、肌肉、心臟、胸神經(jīng)節(jié)

5、、鰓、肝胰腺、腸、卵巢、精巢中均有表達(dá)。但是在性腺中的表達(dá)要明顯高于其他各組織，隨著精巢的發(fā)育變化，piwi mRNA的表達(dá)量逐漸減少，在精母細(xì)胞時期表達(dá)量最高；同樣在卵巢中piwi mRNA也隨著卵巢的發(fā)育而發(fā)生波動，在卵母細(xì)胞期表達(dá)量最高。在胚胎和幼體發(fā)育階段，大眼幼體期表達(dá)量最高。對精巢和卵巢的原位雜交結(jié)果表明，piwi mRNA在精母細(xì)胞中分布于染色質(zhì)中，在精子細(xì)胞中主要分布于核杯中，在卵母細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)，

6、以piwi mRNA陽性信號指示的生殖腺原基在心跳期已比較明顯，溞狀幼體I期時分布于頭胸甲與腹部交接處，隨著發(fā)育逐漸集中于頭胸甲背部，至溞狀幼體II期時已向頭胸甲遷移，溞狀幼體III期時更加集中，完全位于頭胸甲的背面的一個區(qū)域。
　　3、中華絨螯蟹nanos基因克隆及表達(dá)研究
　　nanos mRNA和vasa mRNA是性腺的最初成分P顆粒中的2個最重要的組成成分。本文采用SMARTTM RACE技術(shù)，克隆了中華絨螯蟹na

7、nos基因，nanos基因cDNA序列全長2886bp（GenBank注冊號：KR061910），5’UTR59bp，3’UTR1543bp，開放閱讀框ORF1284bp，編碼427個氨基酸?？缒^(qū)分析表明NANOS蛋白為親水性蛋白結(jié)構(gòu)。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，nanos mRNA在血液、肌肉、心臟、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、肝胰腺、腸、卵巢、精巢中均有表達(dá)，其中在血液中表達(dá)量最低，在性腺中表達(dá)量最高，且精巢中表達(dá)量高于卵巢。卵巢中nanos基

8、因在卵巢發(fā)育的大生長期（對數(shù)生長期）早期達(dá)到峰值，隨著卵巢發(fā)育趨向成熟，有下降趨于平緩的趨勢；在精巢發(fā)育過程中，在7月份的精母細(xì)胞期表達(dá)量最高，后逐漸降低，至精子發(fā)生早期又急劇升高，形成精子后迅速下降。在胚胎和幼體發(fā)育時期，在大眼幼體期的表達(dá)量最高，與其他各期差異極為顯著。對精巢和卵巢的原位雜交結(jié)果表明，nanos mRNA在精母細(xì)胞中分布于染色質(zhì)中，在精子細(xì)胞中主要分布于核杯中，在卵母細(xì)胞中定位于細(xì)胞質(zhì)。整胚原位雜交發(fā)現(xiàn)，以nanos

9、 mRNA陽性信號指示的生殖腺原基在出膜前期比較明顯，溞狀幼體I期時nanos陽性信號分布于頭胸甲與腹部交接處，隨著發(fā)育逐漸集中于頭胸甲背部，至溞狀幼體II期時已完全分布于頭胸甲，溞狀幼體III期時更加集中，完全位于頭胸甲的背面的一個區(qū)域。
　　4、中華絨螯蟹PL10基因克隆及表達(dá)研究
　　PL10基因是vasa的祖先基因。本實(shí)驗(yàn)克隆得到的中華絨螯蟹PL10基因片段序列長1671bp（Genbank注冊號：KR061911）

10、，編碼566個氨基酸。多序列比對和同源性分析表明中華絨螯蟹的PL10基因和秀麗白蝦、日本沼蝦、中國明對蝦同源性分別為85%、84%、84%。系統(tǒng)進(jìn)化分析證明了PL10基因在進(jìn)化上高度保守。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，PL10 mRNA在各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量差異較大，血液、神經(jīng)節(jié)、鰓組織中低量表達(dá)，肝胰腺、精巢、卵巢中高量表達(dá)。對中華絨螯蟹各發(fā)育階段性腺中PL10 mRNA的實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，在12月份的精子形成期達(dá)到高峰

11、，說明PL10基因參與了精子的發(fā)生；在卵巢中PL10 mRNA的表達(dá)在對數(shù)增長前期有小幅上升，對數(shù)生長期后則呈下降趨勢。實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，PL10基因在胚胎中的表達(dá)量高于幼體階段。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育各期及溞狀幼體階段，vasa和nanos的表達(dá)模式相似，說明在此過程中兩者功能相近；PL10基因在胚胎發(fā)育的早期階段的表達(dá)量要高于vasa和nanos，說明PL10的功能與vasa和nanos不盡一致。通過以上的研究和