基于中華絨螯蟹EST序列的深度發(fā)掘-免疫和營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，目前以形成了龐大的產(chǎn)業(yè)，創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)和社會(huì)效益。但隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各種疾病頻發(fā)，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。由于中華絨螯蟹在內(nèi)的甲殼動(dòng)物不具備適應(yīng)性免疫而僅具有先天免疫，所以探明先天免疫相關(guān)基因的作用機(jī)制對(duì)于闡明甲殼動(dòng)物的先天免疫應(yīng)答步驟和機(jī)理，解決生產(chǎn)中碰到的疾病問(wèn)題有深遠(yuǎn)的意義。除了病害，飼料也是制約中華絨螯蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。由于

2、目前國(guó)際魚(yú)粉價(jià)格的居高不下，飼料成本逐漸增加，提高中華絨螯蟹對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率可為緩解當(dāng)前飼料成本居高的想象提供有效手段，而隨著飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用效率的提高，養(yǎng)殖業(yè)對(duì)水體環(huán)境的污染也降低，這又在另一方面促進(jìn)了產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。鑒于以上原因，本論文克隆得到了中華絨螯蟹組織蛋白酶L(catL)，組織蛋白酶C(catC)，組織蛋白酶A(catA)，巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)和脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)基因，分析了其在中華絨螯蟹不同組織

3、中的表達(dá)情況，并研究了病原微生物感染后免疫相關(guān)基因的表達(dá)模式，精巢快速發(fā)育期營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因的的表達(dá)模式和微量元素鋅對(duì)其影響。
　　 1.組織蛋白酶L的基因克隆及其表達(dá)分析
　　 組織蛋白酶家族是廣泛存在與機(jī)體各組織中的一類基因，他們?cè)跈C(jī)體的免疫能力、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用等方面都發(fā)揮了重要作用。中華絨螯蟹catL的cDNA全長(zhǎng)1274 bp，其中包括編碼325個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)為978 bp的開(kāi)放閱讀框。與其他物種catL的氨

4、基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹具有該家族基因所共有的基序?；虻臅r(shí)空表達(dá)分析表明，catL基因在各組織中廣泛表達(dá)，其中在肝胰腺、鰓、胃和血細(xì)胞中的表達(dá)量最高。當(dāng)中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catL基因的mRNA表達(dá)量與酶活都在攻毒后8小時(shí)達(dá)到最高。上述研究證實(shí)catL參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答。
　　 2.組織蛋白酶C的基因克隆及其表達(dá)分析
　　 中華絨螯蟹catC的cDNA全長(zhǎng)1481 bp，其中包括編碼427個(gè)氨基

5、酸殘基的長(zhǎng)為1284 bp的開(kāi)放閱讀框。與其他物種catC的氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯
　　 蟹catC的蛋白質(zhì)序列與其他物種有較高的相似度。當(dāng)中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catC基因的mRNA表達(dá)量在攻毒后6小時(shí)達(dá)到最高。上述研究證實(shí)catC參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答。
　　 3.組織蛋白酶A的基因克隆及其表達(dá)分析
　　 中華絨螯蟹catA的cDNA全長(zhǎng)2200 bp，其中包括編碼465個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)為

6、1398 bp的開(kāi)放閱讀框。與其他物種catA的氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹catA的蛋白質(zhì)序列與其他脊椎動(dòng)物的相似度為48％到51％。CatA的時(shí)空表達(dá)分析表明該基因具有組織依賴性，并且在鰓中的表達(dá)量最高。當(dāng)中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catA基因的mRNA表達(dá)量在攻毒后12小時(shí)達(dá)到最高。上述研究證實(shí)catA參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答。
　　 4.巨噬細(xì)胞游走抑制因子的基因克隆及其表達(dá)分析
　　 MIF作為一種多

7、功能的細(xì)胞因子在先天免疫和后天免疫的應(yīng)答過(guò)程中都有重要作用，但其在甲殼動(dòng)物先天免疫中的作用機(jī)制仍不明。因此我們克隆得到了了中華絨螯蟹的MIF基因，并對(duì)其組織表達(dá)和免疫功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，中華絨螯蟹MIF的cDNA全長(zhǎng)704 bp，其中包括編碼120個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)為363bp的開(kāi)放閱讀框。與其他物種catA的氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹具有該基因所共有的活化位點(diǎn)。MIF的時(shí)空表達(dá)分析表明該基因具有組織特異性，并且在肝胰腺中的表達(dá)量

8、最高。當(dāng)中華絨螯蟹經(jīng)鰻弧菌感染后發(fā)現(xiàn)，catA基因在血淋巴中的mRNA表達(dá)量在攻毒后8小時(shí)達(dá)到最高，在肝胰腺和鰓中的表達(dá)量均在攻毒后12小時(shí)達(dá)到最高。上述研究證實(shí)MIF參與了中華絨螯蟹的先天免疫應(yīng)答。
　　 5.脂肪酸結(jié)合蛋白基因克隆及其在精巢快速發(fā)育期不同組織的表達(dá)分析
　　 FABP是一類對(duì)于機(jī)體脂肪酸運(yùn)輸和代謝有重要作用的蛋白，其功能在脊椎動(dòng)物中已被廣泛研究，但在無(wú)脊椎動(dòng)物，特別是甲殼動(dòng)物中的研究極少。因此我們克隆

9、得到了了中華絨螯蟹的FABP基因，并對(duì)其組織表達(dá)和在精巢快速發(fā)育期不同組織的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，中華絨螯蟹FABP的cDNA全長(zhǎng)898bp，其中包括編碼136個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)為411bp的開(kāi)放閱讀框。與其他物種FABP的氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹具有該基因所共有的簽名序列。FABP的時(shí)空表達(dá)分析表明該基因在中華絨螯蟹各組織中廣泛表達(dá)，并且在腸、卵巢、精巢和心臟中的表達(dá)量最高。對(duì)處于精巢快速發(fā)育期的中華絨螯蟹的FABP基因表達(dá)

10、量的分析表明，各組織中FABP的表達(dá)量都依賴于精巢的發(fā)育階段。研究證明了FABP在中華絨螯蟹精巢快速發(fā)育階段脂肪酸運(yùn)輸和代謝過(guò)程中的重要作用，并間接證明了肝胰腺、精巢、卵巢和血細(xì)胞在脂肪酸運(yùn)輸過(guò)程中的相互作用。
　　 6.飼料鋅對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)、肝胰腺脂肪酸組成和相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 鋅是一類具有多功能的微量元素，與機(jī)體內(nèi)很多含鋅酶和依賴鋅的酶有重要的相互作用，是中華絨螯蟹的必需營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)于中華絨螯蟹的免疫能力和營(yíng)

11、養(yǎng)物質(zhì)代謝能力有重要的作用。為了全面衡量飼料鋅濃度對(duì)中華絨螯蟹生長(zhǎng)、免疫能力和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝能力的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)濃度梯度的含鋅飼料(0，10，20，40 and80 mg/kg飼料)對(duì)中華絨螯蟹飼養(yǎng)8周后測(cè)定了相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，當(dāng)飼料鋅添加量為20mg Zn/kg飼料，飼料鋅實(shí)測(cè)濃度為27 mg Zn/kg飼料時(shí)中華絨螯蟹有最大體增重率。肝胰腺的鋅濃度隨著飼料鋅添加量的增加而提高。肝胰腺的脂肪酸組成隨著飼料鋅濃度的提高而變化。隨