青貯發(fā)酵體系中乳酸菌多樣性的研究.pdf

1、本文以實驗室自制袋裝青貯和不同地區(qū)青貯為樣品，采用PCR—DGGE技術(shù)與傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，比較了玉米青貯和苜蓿青貯動態(tài)發(fā)酵過程中菌群多樣性的變化；研究了不同地區(qū)青貯原料表面附著菌和半年以上青貯中菌群的多樣性。得出以下結(jié)論： 1.玉米青貯和苜蓿青貯中乳酸菌多樣性研究玉米青貯pH值迅速降低，至試驗結(jié)束，青貯各項營養(yǎng)指標均達到優(yōu)質(zhì)青貯指標；而苜蓿青貯pH值一直維持在5.5以上，其余各項營養(yǎng)指標均達到優(yōu)質(zhì)指標。利用細菌V3區(qū)通用引物擴增玉

2、米青貯和苜蓿青貯中微生物16S rDNA，產(chǎn)物經(jīng)DGGE分析發(fā)現(xiàn)，玉米青貯和苜蓿青貯發(fā)酵過程中優(yōu)勢條帶不同；其中?—Acinetobacter、?—Pantoea、?—Escherichia、?—Lactococcus、?—Weissella koreensis、?—Enterobacter等類細菌一直活躍在青貯中；?—Streptococcus、?—Endophytic、?—Enterobacter等細菌7d后從玉米青貯體系中消失，而

3、有些條帶（克隆未成功）是在苜蓿青貯后期逐漸變亮，逐漸占據(jù)優(yōu)勢。利用細菌LAB類通用引物擴增玉米青貯和苜蓿青貯中微生物總16S rDNA，產(chǎn)物經(jīng)DGGE分析發(fā)現(xiàn)，在青貯發(fā)酵過程中以?—Lactobacillus類居多，其次為?—Lactococcus和?—Weissella類；Lactobacillus brevis、?—Acetobacter、?—Leuconostoc在玉米青貯7d后有逐漸消失的趨勢，而這幾株菌在苜蓿青貯中一直存在，且

4、沒有顯著變化。桿菌作為啟動菌株一直存在于玉米及苜蓿青貯發(fā)酵體系中，且在青貯前（0d）及青貯后各時間點，條帶一直較亮。利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對玉米青貯和苜蓿青貯各時間點乳酸菌進行分離、鑒定，共發(fā)現(xiàn)118株，其中乳酸桿菌57株、球菌61株。這些菌分別出現(xiàn)在兩種原料中，并在各個時間分離出的LAB不同，前期以球菌居多，但隨著青貯發(fā)酵時間的延長，青貯中的LAB種類由開始的球菌逐漸演替成桿菌。 2.不同地區(qū)青貯原料表面附著菌及青貯中乳酸菌多樣性研究不同

5、地區(qū)青貯原料及青貯的營養(yǎng)成分差異顯著，青貯中發(fā)酵產(chǎn)物差異性顯著，原料發(fā)酵后符合優(yōu)質(zhì)青貯要求。利用細菌V3區(qū)通用引物擴增不同地區(qū)青貯原料表面附著菌及青貯中微生物16S rDNA，產(chǎn)物經(jīng)DGGE方法分析發(fā)現(xiàn)：同一地區(qū)青貯原料表面附著菌的種類相似性比較高，最高達到93％最低也在80％ 以上；植株表面附著菌多為與青貯發(fā)酵無關(guān)的“雜菌”，LAB類較少，僅發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis subsp.Cremoris、Weissella k

6、oreensis、Lactobacillus buchneri等三種乳酸菌。不同地區(qū)青貯中細菌的種類相似性不高，僅在60％左右。檢測出的菌群含有?—Acinetobacter、?—Pantoea、?—Escherichia、?—Pseudomonas等類“雜菌”，同時還檢測出?—Lactobacillus、?—Lactococcus、?—Weissella等乳酸菌，這些菌群分布在各地區(qū)牧場青貯中。利用LAB類通用引物擴增不同地區(qū)青貯原料

7、表面附著菌及青貯中微生物16SrDNA，產(chǎn)物經(jīng)DGGE方法分析發(fā)現(xiàn)：不同地區(qū)青貯原料表面附著菌的種類相似性比較低，最高也只在75％左右，同一地區(qū)的相似性比較高，均在63％至94％之間：使用該LAB類通用引物擴增，發(fā)現(xiàn)的絕大部分是LAB，且以桿菌為主，球菌較少；其中Weissella confusa、Lactobacillus brevis、Acetobacter ghanensis、Lactococcus lactis、Weissell

8、a hellenica、Lactobacillus plantarum等菌種在九個牧場中均出現(xiàn)。不同地區(qū)青貯中乳酸菌經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)九個牧場相似性不高，在67％至90％ 之間：且半年以上的青貯窖中以乳桿菌為主要類群（?—Lactobacillus），同時仍有球菌（Lactococcus、Weissella、Leuconostoc）出現(xiàn)。利用純培養(yǎng)技術(shù)對不同地區(qū)青貯原料及半年以上青貯中LAB進行分離鑒定，不同地區(qū)青貯原料表面共分離出69株為