甘肅和四川省牦牛奶制品中乳酸菌的多樣性研究.pdf

1、本研究從我國甘肅省和四川省6個縣27個地區(qū)的不同牧民家庭采集牦牛奶及傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品（酸牦牛奶、曲拉、乳清和酥油）共152份，對其中蘊含的乳酸菌采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法進行了分離，利用16S rDNA序列分析等方法對分離株進行了鑒定并分析了其中的乳酸菌多樣性；選取有代表性的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品樣品，采用非培養(yǎng)的宏基因組學方法（PCR-DGGE和焦磷酸測序）對其中的微生物多樣性進行了進一步的研究分析。結論如下：
　　1.采用BCP平板計數(shù)

2、法檢測了所有樣品中乳酸菌活菌總數(shù)，結果顯示乳酸菌活菌數(shù)變化范圍在4.00 lg cfu/mL～9.15 lg cfu/mL，且大多數(shù)樣品乳酸菌數(shù)在6.00 lg cfu/mL以上。同時采用選擇性培養(yǎng)基（MRS和M17）并結合形態(tài)觀察對樣品中的乳酸菌進行了分離，獲得乳酸菌分離株533株。
　　2.通過形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析法對所有的乳酸菌分離株進行了鑒定，對16S rDNA序列相似性高的菌株采用種特異性PCR、PCR-R

3、FLP、DGGE等技術進行了鑒定，最終將所有分離的乳酸菌鑒定到種或亞種水平，建立了鑒定乳酸菌的分子生物學平臺。533株乳酸菌分離株屬于6個屬24個不同的種和亞種，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）246株，占分離乳酸菌總數(shù)46.15％；其次為明串珠菌屬（Leuconostoc）156株，占29.27%；鏈球菌屬（Streptococcus）67株，占12.57%；乳球菌屬（Lactococcus）50株，占9.38%；腸球菌屬（

4、Enterococcus）11株，占2.64%；魏斯氏菌屬（Weissella）3株，占0.56%；在微生物的多樣性上，瑞士乳桿菌（24.2%）和腸膜明串珠菌腸膜亞種（20.64%）是甘肅和四川牦牛奶及傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品中的優(yōu)勢菌種。不同地區(qū)不同種類的牦牛奶制品中乳酸菌組成既有相似性也有差別，如：瑞士乳桿菌是甘肅地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸牦牛奶、曲拉、乳清中的優(yōu)勢菌；而嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌分別是四川酸牦牛奶和曲拉的優(yōu)勢乳酸菌。
　　3.建

5、立了甘肅和四川地區(qū)牦牛奶制品中乳酸菌的16S rDNA基因序列數(shù)據(jù)庫，將分離得到的533株乳酸菌的16S rDNA序列全部上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為HM058517-HM058580，HM058582-HM0059029，HM217942-HM217944，HM217948，HM217953，HM217956，HM217962，HM217964，HM217967，HM217971-HM217975，M217984-HM2179

6、86，HM217994-HM217999。
　　4.采用非培養(yǎng)的PCR-DGGE技術分析研究了四川有代表性的10份曲拉中的微生物多樣性。結果顯示曲拉樣本中包含了9種以上乳酸菌（Lb. helveticus，Lb. plantarum，Lb. fermentum，Lb. paralimentarius，Lb. sanfranciscensis，Leu. citreum，Lb. curvatus，E. durans，Lac. lact

7、is）。
　　5.利用高通量的454焦磷酸測序技術分析了甘肅和四川有代表性的酸牦牛奶樣本中微生物多樣性。結果顯示酸牦牛奶中包含了多種復雜微生物，根據(jù)16S rDNA序列比對后所有細菌被劃分到Firmicutes（厚壁菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門），Deinococcus-Thermus（異常球菌-棲熱菌門），Proteobacteria（變形菌門）和未知的Environme

8、ntal samples（環(huán)境樣本）等6門37屬；Firmicutes的乳酸菌（Lactobacillus，Streptococcus，Lactococcus，Leuconostoc）在酸牦牛奶樣本中占比例最高；且甘肅和四川地區(qū)牦牛奶樣本中細菌主成分具有明顯的地域差異。這些大量的數(shù)據(jù)讓我們對酸牦牛奶中微生物的菌群結構有了全新的認識。
　　6.純培養(yǎng)方法與宏基因組學方法均證實傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品中微生物種類豐富多樣，而且乳酸菌是優(yōu)勢菌

9、，其中乳桿菌最多。所采用的三種分析多樣性的方法各具優(yōu)勢，純培養(yǎng)方法只能分析到可培養(yǎng)菌，優(yōu)點是獲得的純培養(yǎng)菌株可以用于下步發(fā)酵劑的篩選；PCR-DGGE和焦磷酸測序技術都能基于宏基因組學水平揭示菌群結構的。DGGE直觀快速地反映出樣品中優(yōu)勢菌群的構成；通過最新的焦磷酸測序技術得到的OUT數(shù)比PCR-DGGE多，更全面的反映出菌群的組成和豐度。
　　本文系統(tǒng)地研究了中國甘肅和四川地區(qū)牦牛奶及各種傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶制品中乳酸菌的組成，這為益