赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的生理及分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、赤霉素作為一種重要的植物激素,參與控制多種植物發(fā)育和生理過(guò)程,最突出的生理效應(yīng)是促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)。許多研究均表明,赤霉素對(duì)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)效果明顯,顯著增加甘蔗產(chǎn)量。雖然赤霉素處理對(duì)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的作用已經(jīng)得到證實(shí),但機(jī)理尚末清楚。
　　 本研究以甘蔗(Saccharum officinarum L.)品種新臺(tái)糖22號(hào)為材料,在伸長(zhǎng)初期用200mg/L GA3進(jìn)行處理,以清水作對(duì)照,探討赤霉素處理對(duì)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)、生理、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響,并

2、對(duì)赤霉素處理后的甘蔗進(jìn)行差異表達(dá)分析、克隆了甘蔗赤霉素合成關(guān)鍵酶GA20氧化酶基因及定量PCR分析,以便為進(jìn)一步了解赤霉素調(diào)控甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)機(jī)理、更好地利用赤霉素調(diào)控甘蔗生長(zhǎng)提供參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.赤霉素處理后對(duì)甘蔗伸長(zhǎng)效應(yīng)、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響
　　 在甘蔗伸長(zhǎng)初期,赤霉素處理顯著促進(jìn)了節(jié)間伸長(zhǎng),節(jié)間伸長(zhǎng)效果主要集中在中部;莖徑與對(duì)照差異不明顯,單莖重和甘蔗產(chǎn)量比對(duì)照顯著提高。這說(shuō)明赤霉素主要通過(guò)促進(jìn)甘蔗

3、莖伸長(zhǎng),提高單莖重來(lái)提高產(chǎn)量。赤霉素處理對(duì)甘蔗品質(zhì)影響的主要結(jié)果是:蔗糖分提高,還原糖分下降,重力純度、纖維分、錘度和轉(zhuǎn)光度比對(duì)照均有不同程度的提高。
　　 2.赤霉素處理對(duì)甘蔗內(nèi)源激素及相關(guān)酶活性的影響
　　 首次深入分析了赤霉素處理對(duì)甘蔗內(nèi)源激素及相關(guān)酶活性的影響,發(fā)現(xiàn)外源赤霉素處理后,赤霉素和IAA含量含量顯著提高;ABA含量則相反,顯著下降;乙烯釋放量也有所下降;ZR含量沒(méi)有明顯變化;ABA/IAA比值顯著下降;

4、ZR/IAA和EH/IAA的比值也有所下降;而GA3/IAA的比值有所提高。赤霉素處理后,a-葡萄糖苷酶和a-甘露糖苷酶活性顯著下降;POD和β-半乳糖苷酶活性也有所下降,但不顯著;a-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶、過(guò)氧化氫酶活性顯著提高,β-葡萄糖苷酶活性也有一定程度提高。但無(wú)論是對(duì)內(nèi)源激素和酶活性的促進(jìn)作用還是抑制作用主要集中在1個(gè)月左右,這與赤霉素提高甘蔗株高和節(jié)間伸長(zhǎng)效果基本吻合。由此可以推測(cè),外源赤霉素促進(jìn)甘蔗節(jié)間的伸

5、長(zhǎng)可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)ABA和赤霉素含量,其次是乙烯釋放量和生長(zhǎng)素含量,改變了促進(jìn)伸長(zhǎng)的激素與抑制伸長(zhǎng)的激素之間的相對(duì)平衡狀態(tài);同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)a-葡萄糖苷酶、a-甘露糖苷酶、a-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基已糖苷酶和過(guò)氧化氫酶活性,其次是POD、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性,最終達(dá)到促進(jìn)節(jié)間伸長(zhǎng)的效果。
　　 3.cDNA-AFLP和cDNA-SRAP分析赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)的差異表達(dá)
　　 首次采用cDNA-AFLP

6、和cDNA-SRAP兩種技術(shù)分析了赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明,GA3處理和對(duì)照甘蔗幼莖中的轉(zhuǎn)錄組具有很大的差異。兩種技術(shù)通過(guò)對(duì)回收差異片段進(jìn)行反向Northern雜交驗(yàn)證扣除假陽(yáng)性后,得到80個(gè)差異明顯陽(yáng)性片段。對(duì)80個(gè)差異片段進(jìn)行克隆和序列分析并進(jìn)行了BLAST分析,按照功能可以將獲得的80條差異片段分為7類(lèi),分別為能量與代謝相關(guān)基因、未知功能蛋白、未知基因、植物抗性相關(guān)基因、細(xì)胞壁生物合成與修飾相關(guān)基因、信號(hào)傳導(dǎo)

7、相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因。
　　 4.cDNA-SCoT的開(kāi)發(fā)利用及差異表達(dá)分析
　　 本研究首次利用cDNA-SCoT技術(shù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。對(duì)不同模板、引物、體系及擴(kuò)增條件等進(jìn)行研究的結(jié)果表明:以第二鏈純化產(chǎn)物10×稀釋液為模板,擴(kuò)增35循環(huán)的效果最好。根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則我們又新設(shè)計(jì)了10條引物,部分引物擴(kuò)增也取得了很好的效果。cDNA-SCoT這個(gè)方法具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、假陽(yáng)性低、回收差異片段成功率高等特點(diǎn)

8、,對(duì)以后差異表達(dá)將起到重要作用。
　　 采用cDNA-SCoT技術(shù)對(duì)赤霉素誘導(dǎo)甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析,得到56條差異片段。對(duì)回收的差異片段進(jìn)行反向Northern雜交驗(yàn)證扣除假陽(yáng)性后,得到30個(gè)差異明顯的陽(yáng)性片段(ST-TDFs),它們分別代表能量與代謝相關(guān)基因(6條,占總數(shù)的20％)、未知功能蛋白(6條,占總數(shù)的20％)、未知基因(14條,占總數(shù)的46.67％)、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因(2條,占總數(shù)的6.67％)、轉(zhuǎn)錄

9、因子相關(guān)基因(1條,占總數(shù)的3.33％)、細(xì)胞凋亡基因(1條,3.33％)。
　　 5 cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT3種差異表達(dá)技術(shù)比較分析
　　 本研究首次從原理、方法、擴(kuò)增、回收等方面對(duì)cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT3種差異表達(dá)技術(shù)進(jìn)行比較分析,指出cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT技術(shù)均是研究基因差異表達(dá)的重要方法,得到了部分相同的差

10、異片段,大多數(shù)的差異片段各有特點(diǎn)。研究者可以根據(jù)不同的研究方向和目的選擇自己需要的方法或不同方法結(jié)合應(yīng)用,特別是不同的差異表達(dá)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用將能夠獲得更全面的差異片段,從而在植物基因差異表達(dá)、新基因發(fā)現(xiàn)、抗逆性分子機(jī)理研究等方面發(fā)揮更大的作用。
　　 通過(guò)對(duì)3種技術(shù)的差異片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),與甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)生理緊密相關(guān)的基因片段主要是過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶(peroxin)、乙烯合成關(guān)鍵酶(SAMS和SAMDC)、ABA信號(hào)傳

11、遞(1,3,4-trisphosphate5/6-kinase)和赤霉素受體(GID1)。這說(shuō)明本研究所得到的差異片段與甘蔗節(jié)間伸長(zhǎng)中內(nèi)源激素及相關(guān)酶活性的表現(xiàn)是有一致的。
　　 6.赤霉素受體基因GID1定量PCR分析
　　 首次通過(guò)熒光定量PCR分析了3種差異表達(dá)技術(shù)所獲得的甘蔗共同差異基因片段赤霉素受體基因GID1表達(dá)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)末經(jīng)處理(0 h)的表達(dá)量最低,赤霉素處理后表達(dá)量逐漸提高,在6 h達(dá)到最大值,雖然12

12、 h后逐漸下降,但到48 h又明顯上升,且所有處理的表達(dá)量均高于對(duì)照(0 h),說(shuō)明赤霉素受體基因GID1與節(jié)間伸長(zhǎng)呈正相關(guān),這可能是由于體內(nèi)赤霉素含量的提高影響到赤霉素的受體GID1在核內(nèi)與DELLA蛋白的結(jié)合能力的結(jié)果。
　　 7.甘蔗GA20氧化酶基因克隆及定量PCR分析
　　 本研究首次從甘蔗中克隆到GA20氧化酶基因片段,由740堿基組成,編碼246個(gè)氨基酸。與禾本科植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列

13、的同源性都在80％和75％以上,特別與親緣關(guān)系近的玉米和高粱之間的同源性高達(dá)88％,大部分區(qū)域可達(dá)完全一致。系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明,甘蔗GA20氧化酶最先與親緣關(guān)系近的玉米聚類(lèi),再和高粱聚類(lèi)。通過(guò)熒光定量PCR分析甘蔗GA20氧化酶基因表達(dá)情況,結(jié)果表明,未經(jīng)處理(0 h)的表達(dá)量最大,赤霉素處理后表達(dá)量持續(xù)下降,在6 h達(dá)到最低值,雖然12 h后逐漸上升,但到48 h又明顯下降,且所有處理的表達(dá)量均低于對(duì)照(0 h)。這可能是外施赤霉素后