內(nèi)生固氮菌DX120E與甘蔗互作的生理和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、甘蔗是重要的糖料和能源作物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需肥量大，尤其是氮肥。廣西是甘蔗種植大省，蔗糖年產(chǎn)量約占全國(guó)的70％。然而廣西的甘蔗種植地區(qū)大量施用氮肥，不僅成本高而且還會(huì)造成環(huán)境污染。因此，我們需要尋找一種能夠減少氮肥施用的有效途徑，生物固氮?jiǎng)t是最佳的選擇。目前，已有研究人員從廣西主栽甘蔗品種中分離和鑒定到一批固氮菌并對(duì)部分幾個(gè)固氮菌做了初步的接種試驗(yàn)。然而，至今尚未發(fā)現(xiàn)有對(duì)聯(lián)合固氮菌與甘蔗互作開(kāi)展比較系統(tǒng)研究的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)從廣西主栽甘

2、蔗品種新臺(tái)糖22號(hào)中分離鑒定的一株固氮菌DX120E進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并用該固氮菌接種兩個(gè)不同甘蔗品種后比較該固氮菌對(duì)甘蔗生長(zhǎng)生理特性的影響，比較了該固氮菌與固氮模式菌株P(guān)AL5的固氮能力，同時(shí)還進(jìn)行了固氮菌DX120E與甘蔗組培苗互作的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，旨在探討固氮菌DX120E促進(jìn)甘蔗生長(zhǎng)和固氮的生理和分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.固氮菌DX120E在2個(gè)甘蔗品種（B8和GT21）的根、葉鞘和葉內(nèi)均能定殖，定殖的細(xì)菌量

3、依次為根＞葉鞘＞葉。DX120E可以從甘蔗根表面的裂隙、主根和側(cè)根發(fā)生處及根的斷裂處入侵，主要在根表面細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)大量定殖，同時(shí)也可遷移到葉片的葉肉細(xì)胞和維管束細(xì)胞中定殖;不同接種濃度下，最大定殖數(shù)量無(wú)顯著差異，1×102 CFU mL-1的接種量足夠侵入甘蔗并積累定殖。
　　2.接種固氮菌DX120E可以有效促進(jìn)甘蔗植株生長(zhǎng)和對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，顯著提高甘蔗植株體內(nèi)的硝酸還原酶(NR)活性，同時(shí)也能在一定程度上提高植株體內(nèi)谷氨

4、酰胺合成酶(GS)活性，增加硝態(tài)氮含量，接種固氮菌DX120E還能顯著提高兩個(gè)甘蔗品種葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)。固氮菌DX120E與固氮模式菌株P(guān)AL5比較接種試驗(yàn)表明兩種固氮菌均具有固氮能力，并且固氮菌DX120E表現(xiàn)出具有比固氮菌PAL5更高的固氮效率。
　　3.根據(jù)16S rRNA、rpoB和gyrA三個(gè)基因的克隆和測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果，固氮菌DX120E歸屬為變棲克雷伯氏菌（Kle

5、bsiella variicola）。全基因組測(cè)序的結(jié)果顯示DX120E基因組包含一條環(huán)狀染色體和兩個(gè)質(zhì)粒。其中包含了5，718，434個(gè)核苷酸，GC含量57.1％，5172個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，25個(gè)rRNA基因，87個(gè)tRNA基因，25個(gè)假基因和2個(gè)成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)。GOC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株DX120E基因組進(jìn)行功能注釋的結(jié)果顯示在已知的基因功能分類中，糖類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和轉(zhuǎn)錄這三個(gè)功能所占的比例最

6、高，分別占預(yù)測(cè)總蛋白總數(shù)的11.3％、10.4％和9.5％。
　　4.利用雙向電泳技術(shù)，共找到固氮菌DX120E與甘蔗組培苗在1/10 MS液體培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后固氮菌的差異表達(dá)蛋白共22個(gè)，質(zhì)譜鑒定成功18個(gè)，其中有8個(gè)上調(diào)表達(dá)，10個(gè)下調(diào)表達(dá)。鑒定到的差異蛋白質(zhì)主要參與了能量、代謝（氨基酸代謝和碳水化合物代謝）、防衛(wèi)反應(yīng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)這4種功能，各類功能蛋白分別占總差異蛋白質(zhì)的38.9％、27.8％、22.2％和11.1％。利

7、用ITRAQ結(jié)合質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，共獲得與固氮菌DX120E共培養(yǎng)48 h后甘蔗組培苗根以上部分的差異表達(dá)蛋白246個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)240個(gè)（已知蛋白109個(gè)），下調(diào)表達(dá)6個(gè)（已知蛋白4個(gè)）。這些已知差異表達(dá)蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)的分子功能主要分成11類，其中參與防衛(wèi)反應(yīng)占23.9％，參與代謝反應(yīng)占16.5％，參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化（包括蛋白質(zhì)合成、折疊加工以及蛋白質(zhì)水解）占12.8％，參與能量代謝以及光合作用的均占10.1％，參與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的